МОЛБИОЛ 2014-лекции / ООФ / Л06-Генетическая рекомбинация _1

Еще одна функция конверсионной системы - контроль над гомеологичной рекомбинацией

•Гомеологическая рекомбинация - кроссинговер между родственными, но дивергировавшими последовательностями ДНК.

•Набор генов, происшедших путем дупликаций и изменений от некоторого генапредка, называется семейством генов.

–Члены одного семейства могут быть расположены рядом и/или разбросаны по разным хромосомам.

–Члены одного семейства могут иметь сходные или идентичные функции, но могут экспрессироваться в разное время или в разных типах клеток.

–К примерам такого рода относятся гены рРНК и гистонов.

•Контроль такой рекомбинации должен препятствовать

–нежелательным перестройкам между членами уже дивергировавших семейств генов и

–генетическим обменам при межвидовой гибридизации.

он обеспечивает стабильность и целостность геномов, с одной стороны, и генетическую изоляцию - с другой.

•Существуют два механизма подавления гомеологичной рекомбинации.

–Основной механизм действует путем подавления едва начавшейся рекомбинации, запрещая миграцию ветвления, с последующим выбрасыванием внедрившейся в гетеродуплекс чужеродной ДНК с помощью хеликазы MutU.

–Второй механизм зависит от белка MutH, но в нем также участвуют MutS и MutL. Детали его пока не выяснены.

31

– У дрожжей и клеток млекопитающих обнаружено участие в этом подавлении

гомологов MutS - белков MSH2 и MSH3.

Механизм, предотвращающий дестабилизацию генома

32

Figure 5-67 Molecular Biology of the Cell (© Garland Science 2008)

Основные белки, участвующие в гомологичной рекомбинации

•Процесс гомологичной рекомбинации разделяют на три основные стадии:

–ПРЕСИНАПСИС – подготовка ДНК-субстрата к рекомбинации: введение разрывов, образование участка однонитевой ДНК и т.д.

–СИНАПСИС – нахождение гомологии и обмен цепями между рекомбинирующими ДНК.

–ПОСТСИНАПСИС – миграция и разрешение структуры Холлидея.

По этим стадиям принято классифицировать белки, осуществляющие рекомбинацию

33

Рекомбинация у E. coli

•Клетки E. coli способны к обмену генетической информацией с помощью двух процессов: конъюгации и трансдукции.

Конъюгация

–Контакт между клетками разных половых типов

–Из клетки донора в клетку реципиента передается одна из двух цепей кольцевой ДНК.

–Связь между конъюгирующими бактериальными клетками непрочная и они постепенно расходятся

–В результате расхождения клеток перенос ДНК прекращается.

–Реципиентные клетки получают от донора только часть хромосомной ДНК. полную однонитевую кольцевую, а только ее часть,

–Перенесенная ДНК сразу достраивается до линейного двуцепочечного фрагмента с тупыми концами.

Трансдукция

–Из клеток донора в клетку реципиента с помощью бактериофага переносится двуцепочечный фрагмент бактериальной хромосомы,

Основной путь рекомбинации у E. coli - RecBCD

•При конъюгации и трансдукции в реципиентной клетке оказывается линейный дуплекс донорной ДНК с тупыми концами, необходимыйдля рекомбинации с реципиентной хромосомой с участием RecBCD.

•Рекомбинацию инициирует RecBCD-нуклеаза, субъединицы которой кодируются генами recB, recC и recD.:

•Для ферментативной активности ей необходим гидролиз АТФ.

•RecBCD может гидролизовать одно- и двуцепочечную ДНК, притом с обоих концов, то есть работать как экзонуклеаза.

•Имеет хеликазную активность - расплетает дуплекс ДНК, затрачивая на это энергию АТФ.

•Работает как сайт-специфическая эндонуклеаза: расщепляет одноцепочечную ДНК около особой 8-нуклеотидной последовательности 5'-GCTGGTGG-3', называемой Chi-сайтом.

35

Основной путь рекомбинации у E. coli - RecBCD

•д. е. На 3'-конце сначала формируется филамент, затем образуется D-петля (закрытая, так как возникает в кольцевой хромосоме).

•ж. Затем D-петля разрезается с помощью одной из эндонуклеаз E. coli, что приводит к полухиазме Холлидея.

•5'-Концевая часть разорванной цепи ДНК, вероятно, удаляется несколько раньше с помощью экзонуклеазной активности RecBCD.

•з. Далее ДНК-полимераза и ДНК-лигаза должны залечить брешь и разрывы в цепях.

•Такие же события происходят на другом конце

донорной ДНК E.coli, что обеспечивает парность 37

обменов при рекомбинации с хромосомой реципиента.

RecA - главный белок рекомбинации у Е.coli

•В лаборатории А. Кларка в США был выделен и изучен набор мутантов с нарушениями рекомбинации. С помощью этих мутантов, названных rec, были установлены соответствующие гены, а затем выделены белки, участвующие в рекомбинациии.

•На одинарную цепь на 3‘-конце ДНК воздействует несколько белков, которые направляют ее инвазию в дуплекс гомологичной ДНК.

Основным из них является белок RecA (у Е.coli) или его гомолог Rad51 (у эукариот).

•RecA - эволюционно консервативный небольшой белок (около 38 кДа), способный к кооперативному (его молекулы собираются на ДНК по принципу «конец-в-конец») связыванию с любой формой одноцепочечной ДНК.

•Для активации мономера необходимы АТФ и однонитевая ДНК.

•Участвует не только в рекомбинации, но и в репарации ДНК.

•Основное назначение белка RecA - приводить во взаимодействие одноцепочечную ДНК с гомологичным дуплексом.

•Действует кооперативно с белком SSB и ДНК-гиразой;

•Является ДНК-зависимой АТФазой (одна молекула АТР расщепляется до

RecA - главный белок рекомбинации у Е.coli

•Свойства белка RecA определяется наличием у него двух сайтов связывания с ДНК.

•Первый сайт используется для первичного связывания с ДНК.

–В присутствии АТФ белок взаимодействует в этом сайте с одноцепочечной ДНК (ssDNA), образуя вокруг ДНК правозакрученную белковую спираль.

–Возникает нитевидное образование - RecA-ДНК-филамент.

•В первых этапах формирования филамента участвует белок SSB, который распрямляет цепь ДНК и позволяет белку RecA строить филамент, но затем SSB вытесняется белком RecA.

•В условиях in vivo в сборке филамента участвуют и другие дополнительные белки.

•Второй сайт RecA используется для связывания RecA-ДНК- филамента со второй молекулой - «голой» двуспиральной ДНК (АТФ-независимая обратимая стадия). Связывание слабое – имеют место лишь кратковременные контакты (соударения). Эти контакты становятся прочными только после нахождения гомологичных последовательностей, когда происходит спаривание в гетеродуплекс.

39

Сборка RecA-филамента

•Сборка филамента происходит в направлении 5’-3’ относительно цепи ДНК, вокруг которой он строится.

•Цепь ДНК располагается вдоль внутренней оси филамента.

•Если однонитевая ДНК находится в составе двунитевой ДНК (хвост или брешь), то формирующийся на ней филамент может перейти на дуплекс.

•Внутри филамента двунитевая ДНК вытянута в 1,5 раза по сравнению с В- формой ДНК.

•В филаменте двуцепочечная ДНК изменяет свою конформацию. В отличие от обычной В-формы ДНК (где шаг спирали составляет 10,4 п.н.) на один виток спирали ДНК в филаменте приходятся 18,6 п.н., в результате чего ДНК оказывается растянутой в 1,5 раза.

•Считается, что такое растяжение дуплекса необходимо для его последующего взаимодействия с гомологичной одноцепочечной ДНК.