Volume1
.pdf
358 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.54. Хромосомы типа ламповой щетки. а) Полученный на световом микроскопе микрофотоснимокхромосомтипаламповойщеткивооцитеземноводного.Нараннихстадияхдифференцировки ооцита каждая хромосома реплицируется, чтобы начать мейоз, и гомологичные реплицированные хромосомыспариваютсяиобразуютэтупротяженнуюструктуру,содержащуювцеломчетыремолекулы реплицированной ДНК, или хроматиды. Стадия ламповой щетки сохраняется в хромосоме в течение многих месяцев или лет, пока ооцит создает запас материалов, требующихся для его окончательного развитиявновуюособь.б)Увеличеннаяобластьподобнойхромосомы,окрашеннойфлуоресцентным реактивом, который позволяет ясно различить петли, на которых происходит синтез РНК. (Снимки любезнопредоставленыJ. G. Gall.)
Такие хромосомы производят большие количества РНК для ооцита, и большинство генов, расположенных в петлях ДНК, активно экспрессируются. Однако бóльшая часть ДНК находится не в петлях, а остается в высококонденсированной форме в хромомерах на оси, где гены, как правило, не экспрессируются.
Думают, что интерфазные хромосомы всех эукариот подобным образом организованы в виде петель. Хотя эти петли обычно слишком малы и хрупки, чтобы их можно было легко наблюдать в световой микроскоп, можно обнаружить их наличие с помощью других методов. Например, стало возможно оценить частоту, с который любые два локуса интерфазной хромосомы контактируют друг с другом, и таким образом определить вероятные потенциальные участки на хроматине, которые формируют сильно сближенные основания петельных структур (рис. 4.56). Эти и другие эксперименты дают возможность предположить, что ДНК в хромосомах человека организована в петли различной длины. Типичная петля может содержать от 50 000 до 200 000 пар нуклеотидов ДНК, хотя допустимым и вполне возможным пределом является миллион пар нуклеотидов (рис. 4.57).
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 359
Рис.4.55.Модельструктурыхромосомытипаламповойщетки.Наборхромосомтипаламповойщетки умногихземноводныхсодержитвобщемоколо10 000хроматиновыхпетель,хотяосновнаядоляДНК во всех хромосомах остается в высококонденсированной форме и пребывает в хромомерах. Каждая петлясоответствуетопределеннойпоследовательностиДНК.Вкаждойклеткеимеетсяпочетырекопии каждой петли, так как каждая из двух главных единиц, показанных в верхней части рисунка, состоит из двух сильно сближенных недавно реплицированных хромосом. Такая четырехнитевая структура характернадляэтойстадииразвитияооцита(диплотеннаястадиямейоза);см.рис.21.9.
4.4.2. Политенные хромосомы как ничто иное пригодны для демонстрации структур хроматина
Некоторые гигантские клетки насекомых выросли до своих огромных размеров за счет многократных циклов синтеза ДНК, не сопровождавшегося делением клетки. Такие клетки с комплементом ДНК, превышающим нормальный, являются, как говорят, полиплоидными и содержат повышенное число стандартных хромосом. Но у личинок мухи в секреторных клетках нескольких типов все гомологичные копии хромосом удерживаются бок о бок, подобно соломинкам для питья в коробке, и образуют отдельные крупные политенные хромосомы. Поскольку в некоторых случаях политенные хромосомы могут распасться и дать начало обычной полиплоидной клетке, эти два состояния хромосом близко связаны между собой. Поэтому внутренняя структура политенной хромосомы должна быть подобна таковой нормальной хромосомы.
360 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис. 4.56. Метод определения положения петель в интерфазных хромосомах. В этой методике, из-
вестнойподназваниемметода3C(chromosomeconformationcupture;захватконформациихромосомы), клеткиобрабатываютформальдегидом,чтобысоздатьобозначенныенарисункековалентныепоперечные сшивки типа ДНК–белок и ДНК–ДНК. Затем ДНК обрабатывают нуклеазой рестрикции, которая нарезает ее на множество кусочков, производя разрезы в строго определенных последовательностях нуклеотидов и формируя наборы идентичных «липких концов» (см. рис. 8.34). Липкие концы могут соединиться друг с другом за счет комплементарного спаривания оснований. Важно, чтобы перед показаннымшагомлигированияДНКнаходиласьвраствореннойформе,стемчтобыфрагменты,которые поддерживались в близком соседстве друг с другом (при помощи поперечных сшивок), соединились с наибольшей вероятностью. Наконец, поперечные сшивки разрушаются, и недавно лигированные фрагментыДНКидентифицируютиопределяютихколичествоприпомощиПЦР(полимеразнаяцепная реакция, описанная в главе 8). Объединив информацию о частоте контактов сегментов ДНК, полученную 3C-методом, с информацией о последовательности ДНК, можно построить структурные модели конформацииинтерфазныххромосом.
Политения была лучше всего изучена в клетках слюнных желез личинок плодовой мушки дрозофилы. Когда такие политенные хромосомы рассматривают
всветовой микроскоп, заметны отдельные чередующиеся темные полосы, или ди- ски, и светлые междисковые участки (рис. 4.58), каждый из которых образован из тысяч идентичных последовательностей ДНК, расположенных в ряд бок о бок. Приблизительно 95 % ДНК в политенных хромосомах находится в дисках, а 5 % —
вмеждисковых промежутках. Очень тонкая полоса может содержать 3 000 пар нуклеотидов, тогда как толстая полоса может содержать 200 000 пар нуклеотидов
вкаждой из своих хроматиновых нитей. Хроматин в каждом диске выглядит темным, потому что в них ДНК уплотнена сильнее, чем ДНК в междисковых участках; к тому же в диске может содержаться более высокая доля белков (рис. 4.59).
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 361
Рис.4.57.Модельорганизацииинтерфазнойхромосомы.Схематическоеизображениеучасткаинтер-
фазнойхромосомы,имеющегопетельнуюорганизацию.Каждыйизпетлеобразныхдоменовсодержит, возможно,50 000–200 000парнуклеотидовдвойнойспиралиДНК,конденсированнойв30-нмфибрил- лу. Хроматин в каждой отдельной петле еще более конденсирован благодаря пока еще недостаточно понятым процессам фолдинга, которые обращаются вспять, когда клетка требует прямого доступа к ДНК, упакованной в петле. Ни состав постулированной хромосомной оси, ни то, как свернутая 30-нм фибриллазакрепляетсянаней,неясны.Однаковмитотическиххромосомахоснованияхромосомных петельобогащеныиконденсинами,иферментамиДНК-топоизомеразамиII—двумябелками,которые могутформироватьвовремяметафазыбольшуючастьоси(см.рис.4.74).
В полном наборе политенных хромосом дрозофилы насчитывается приблизительно 3 700 полос и 3 700 междисков. Полосы могут быть идентифицированы по их различной толщине и разным промежуткам в их взаимной разбивке, и каждой из них был присвоен номер, чтобы построить «карту» хромосом, которая была индексирована в соответствии с секвенированной последовательностью генома этой мухи.
Политенные хромосомы дрозофилы служат хорошей отправной точкой для изучения организации хроматина высокого уровня. В предыдущем параграфе мы увидели, что существует много форм хроматина и каждая из них содержит нуклеосомы с различной комбинацией модифицированных гистонов. В ходе считывания такого гистонового кода определенные наборы негистоновых белков собираются на нуклеосомах и влияют на биологическую функцию тем или иным образом. Некоторые из этих негистоновых белков могут распространяться по ДНК на значительные расстояния, сообщая подобную структуру хроматина смежным областям генома (см. рис. 4.46). Так, в некоторых областях весь хроматин имеет подобную структуру и отделен от соседних доменов барьерными белками (см. рис. 4.47). Поэтому при низком разрешении интерфазная хромосома может рассматриваться как чересполосица структур хроматина, каждая из которых содержит специфические модификации нуклеосом, сопряженные со специфическим набором негистоновых белков. (При более высоком уровне разрешения в глаза бросается множество специфичных к последовательности ДНК-связывающих белков, которые будут описаны в главе 7).
Такая картина интерфазной хромосомы помогает нам интерпретировать результаты, полученные в ходе исследований политенных хромосом. Путем окрашивания высокоспецифичными антителами можно показать, что на разных дисках политенных хромосом гистоны модифицированы по-разному (рис. 4.60), а также различны наборы негистоновых белков. Это наводит на мысль о мощной общей стратегии. Применяя сочетания антител, прочно связывающихся с соответствующими модификациями гистонов, которые создают гистоновый код (см. рис. 4.39), можно определить, какие
362 Часть 2. Основные генетические механизмы
Рис.4.58.ПолныйнаборполитенныххромосомизклеткислюннойжелезыDrosophila melanogaster.
Наэтойиллюстрации,полученнойнасветовоммикроскопемикрофотоснимка,гигантскиехромосомы длябольшейнаглядностирасправленынапредметномстеклеиприжатыпокровнымстеклом—«раз- давлены». Дрозофила имеет четыре хромосомы, и четыре различные пары хромосом представлены. Но каждая хромосома крепко спарена со своим гомологом (так что каждая пара выглядит как единая структура), что не свойственно большинству ядер (разве только во время мейоза). Каждая хромосома подверглась многократным циклам репликации, и гомологи, а также все их дубликаты остались в точномстроевомпорядкедругсдругом,врезультатечегообразовалисьогромныехроматиновыеканаты, состоящиеизмножестванитейДНК.
Все четыре политенные хромосомы обычно связаны друг с другом гетерохроматиновыми областями около своих центромер, которые объединяются и образуют единый большой хромоцентр (розовая область).Однаковэтомпрепаратехромоцентрбылраздробленнадвечастиприпроцедуре«раздавливания». (Переработано на основе T. S. Painter, J. Hered. 25: 465–476, 1934. С любезного разрешения издательстваOxfordUniversityPress.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 363
Рис.4.59.МикрофотографииполитенныххромосомвслюнныхжелезахDrosophila melanogaster. а)Получен-
ныйнаоптическоммикроскопемикрофотоснимокучасткахромосомы.ДНКбылаокрашенафлуоресцентным красителем,ноздесьпредставленообращенноеизображение,вкоторомбелыеучасткиДНКвыглядятчерными; ясновидно,чтодискиявляютсяобластямиповышеннойконцентрацииДНК.Этахромосомабылаобработана привысокомдавлении,чтобыотличающийеепрофильраспределенияполосимеждисковыхпромежутков проявился более четко. б) Электронный микрофотоснимок маленького участка политенной хромосомы дрозофилы, наблюдаемого в тонком срезе. Легко различимы полосы, сильно отличающиеся по толщине и отделенные междисковыми промежутками, в которых хроматин находится в менее конденсированной форме.(ИллюстрацияапереработанаизD. V. Novikov,I. KireevandA. S. Belmont,Nat.Methods4:483–485,2007.
СблагосклонногоразрешенияMacmillanPublishersLtd.СнимокблюбезнопредоставленVeikkoSorsa.)
Рис. 4.60. Картина модификаций гистонов на политенных хромосомах Drosophila melanogaster. Антитела,
которыеспецифичноузнаютразличныемодификациигистонов,могутуказатьместоположениекаждойтакоймодификациисредимножествадисковимеждисковыхпромежутковнаэтиххромосомах.Вдвухпоказанныхздесь препаратахсравниваютсяположениядвухразличныхметокнахвостахгистонаH3.Вобоихслучаяхантитело, «пометившее»модифицированныйгистон,окрашенозеленым,аДНК—красным.Показанатолькомаленькая область,окружающаяхромоцентр.а)Диметиллизин9(зеленый)—модификациягистона,относящаясякпри- центромерномугетерохроматину.Какэтовидно,меткасвязанасхромоцентром.б)Ацетилированныйлизин 9 (зеленый) — модификация, которая сосредоточена в гистонах, связанных с активными генами. Как видно, этаметкаприсутствуетвмногочисленныхполосахнаплечаххромосомыиотсутствуетвгетерохроматиновом хромоцентре.Подобныеэкспериментымогутбытьпроведенысцельюопределенияместоположениямногих другихмодифицированныхгистонов,атакженегистоновыхбелков(см.,например,нарис.22.45хромосомы, окрашенные для идентификации белка Polycomb). (Переработано на основе A. Ebert, S. Lein, G. Schotta and G. Reuter,ChromosomeRes.14:377–392,2006.СлюбезногоразрешенияиздательстваSpringer.)
364 Часть 2. Основные генетические механизмы
сочетания модификаций характерны для тех или иных типов хроматиновых доменов. А выполняя подобные эксперименты с антителами, которые узнают каждый из сотен различных негистоновых белков в хроматине, можно попытаться расшифровать множество различных загадок, закодированных в модификациях гистонов.
4.4.3. Существует множество форм гетерохроматина
Молекулярные исследования привели к переоценке нашего взгляда на гетерохроматин. В течение многих десятилетий гетерохроматин представлялся единообразным веществом, для которого характерна сильно уплотненная (высококонденсированная) структура и которое способно перманентно «заглушать» гены. Но если мы определяем гетерохроматин как форму компактного хроматина, способную заглушать гены, наследоваться по эпигенетическому механизму и распространяться по хромосомам, чтобы вызывать мозаичный эффект положения (см. рис. 4.36), то становится ясно, что существуют различные типы гетерохроматина. Фактически мы уже рассмотрели три таких типа при обсуждении центромеры у человека (см. рис. 4.50).
Каждый домен гетерохроматина, как думают, образуется совместной сборкой набора негистоновых белков. Например, классический прицентромерный гетерохроматин содержит более шести таких белков, в том числе и гетерохроматиновый белок 1 (HP1), тогда как так называемая форма Polycomb гетерохроматина содержит подобное число белков из неперекрывающегося набора (белки PcG). Есть сотни маленьких блоков гетерохроматина, разбросанных по плечам политенных хромосом Drosophila и определенных по их поздней репликации (обсуждается
вглаве 5). Результаты окрашивания таких областей гетерохроматина антителами указывают на то, что известные формы гетерохроматина могут объяснить не более половины гетерохроматиновых политенных полос (рис. 4.61). Таким образом, должны существовать и другие типы гетерохроматина, белковый состав которых не известен. По всей вероятности, все эти типы гетерохроматина регулируются поразному и играют различную роль в клетке.
Структура хроматина во всех доменах в конечном счете зависит от белков, которые связываются с определенными последовательностями ДНК и которые, как известно, изменяются в зависимости от типа клетки и стадии ее развития
вмногоклеточном организме. Таким образом, и картина распределения хрома-
Рис. 4.61. Свидетельство в пользу существования множестваформгетерохроматина.Вданномисследовании
240 поздно реплицируемых участков на плечах политенных хромосом дрозофилы изучили на предмет присутствия двух негистоновых белков. Известно, что эти белкиспособствуюткомпактизациидвухразличныхформ гетерохроматина(см.текст).Какобозначено,окрашивание антителами предполагает, что примерно половина участковупакованавтеформыгетерохроматина,которые отличаются от этих двух. Эксперименты наподобие этих демонстрируют,чтомызнаемобупаковкеДНКэукариот гораздоменьше,чемнамещепредстоитузнать.(Данные заимствованыизI. F. ZhimulevandE. S. Belyaeva,BioEssays
25:1040–1051,2003.Слюбезногоразрешенияиздатель-
стваJohnWiley&Sons.)
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 365
тиновых доменов, и их индивидуальный состав (модификации нуклеосом плюс негистоновые белки) могут быть различными в разных тканях. Эти различия делают разные гены доступными для генетического считывания и помогают объяснить рост многообразия клеток, который сопутствует развитию зародыша (описано в главе 22). Сравнения политенных хромосом в двух различных тканях мухи заложили основу этому общему представлению: хотя картины распределения дисков и междисковых участков в значительной степени одинаковы, есть воспроизводимые различия.
4.4.4. Петли хроматина становятся менее конденсированными во время экспрессии расположенных в них генов
Когда насекомое переходит из одной стадии развития в другую, в его политенных хромосомах возникают характерные вздутия, или хромосомные пуфы, а старые пуфы спадают, по мере того как новые гены начинают экспрессироваться, а старые выключаться (рис. 4.62). Осмотр каждого такого вздутия, когда оно является относительно маленьким и картина полосчатости все еще различима, показывает, что большинство вздутий появляется в результате деконденсации тех или иных хромосомных дисков.
Отдельные хроматиновые фибриллы, которые образуют пуф, можно наблюдать
вэлектронный микроскоп. В благоприятных случаях заметны петли, во многом напоминающие наблюдаемые в хромосомах типа ламповых щеток, свойственных земноводным, о которых было сказано раньше. В отсутствие экспрессии петля ДНК принимает утолщенную структуру, возможно, свернутой 30-нм фибриллы, но когда происходит экспрессия гена, петля растягивается. На полученных с помощью электронной микроскопии фотографиях хроматин, расположенный по обе стороны от деконденсированной петли, кажется значительно более компактным, а это предполагает, что петля представляет собой обособленный функциональный домен структуры хроматина.
Наблюдения, сделанные при исследовании клеток человека, также позволяют предположить и то, что плотно свернутые петли хроматина расширяются, как бы стараясь занять больший объем, когда находящийся в них ген экспрессируется. Например, находящиеся в состоянии покоя области хромосомы протяженностью от 0,4 до 2 миллионов пар нуклеотидов в длину имеют вид компактных крапин
винтерфазном ядре, когда их наблюдают с помощью флуоресцентной микроскопии с применением FISH или иных технологий. Однако та же самая ДНК, согласно наблюдениям, занимает бóльшую территорию, когда ее гены экспрессируются, при этом первоначальной точке на смену приходят продолговатые крапчатые структуры.
Рис. 4.62. СинтезРНК впуфах политенных хромосом. Автора-
диографический снимок отдельного пуфа в политенной хромосомеизслюнных желез комара-звонца C.tentans.Какбыло упомянутовглаве1ибудетподробноописановглаве6,первый этапэкспрессиигена—синтезмолекулыРНКсиспользованием ДНК в качестве матрицы. На разуплотненном участке хромосомы происходит синтез РНК, которая метится 3H-уридином (см. разд. 9.1.17) — молекулы РНК-предшественника, которая встраивается в растущие цепи РНК. (Снимок любезно предо-
ставленJ.Bonner.)
366 Часть 2. Основные генетические механизмы
4.4.5. Хроматин способен перемещаться в особые участки ядра, чтобы варьировать в них экспрессию генов
Новые способы визуализации отдельных хромосом показали, что каждая из 46 интерфазных хромосом в клетке человека, как правило, занимает свою собственную обособленную территорию в пределах ядра (рис. 4.63). Однако картины наподобие изображенной на этом рисунке дают лишь среднестатистический взгляд на распределение ДНК в каждой хромосоме. Эксперименты, которые определяют местоположение определенных областей гетерохроматина в хромосоме, показывают, что часто они бывают тесно связаны с ядерной пластинкой, независимо от того, какую из хромосом мы наблюдаем. А ДНК-зонды, которые предпочтительно окрашивают богатые генами области хромосом человека, дают поразительную картину интерфазного ядра, которая предположительно отражает различные среднестатистические позиции активных и неактивных генов (рис. 4.64).
Рис. 4.63. Одновременное проявление хромосомных территорий всех хромосом человека в одном ядре на стадии интерфазы. Анализ FISH, в котором используется различная смесь флуорохромов для меченияДНКкаждойхромосомы.Детекцияпосемицветовымканаламфлуоресцентногомикроскопа позволяетразличитькаждуюхромосомувтрехмерномизмерении.Справаотмикрофотографиикаждая хромосомаопознананасхемедействительногоизображения.Обратитевнимание,чтодвегомологичные хромосомы(например,двекопиихромосомы9),какправило,нерасполагаютсяпарами.(Заимствовано из M. R. Speicher and N.P. Carter, Nat. Rev. Genet. 6: 782–792, 2005. С любезного разрешения Macmillan PublishersLtd.)
Разнообразие проведенных экспериментов различных типов позволило прийти к заключению, что положение гена внутри ядра изменяется, когда начинается его интенсивная экспрессия. Таким образом, область, которая становится интенсивно транскрибируемой, как часто находят, простирается за пределы своей хромосомной территории, как это имеет место в расширившейся петле (рис. 4.65). В главе 6 мы увидим, что запуск транскрипции — первый шаг в процессе экспрессии гена — требует сборки более чем 100 белков, и кажется вполне разумным, что она будет происходить наиболее быстро в тех областях ядра, которые обогащены этими белками в наибольшей степени.
В более общем виде перед нами предстает картина весьма неоднородного ядра, состоящего из различных в функциональном отношении областей, в которые части
Глава 4. ДНК, хромосомы и геномы 367
Рис. 4.64. Распределение богатых генами областей генома человека в интерфазном ядре. Детекцию богатых генами областей проводили спомощьюфлуоресцентногозонда,гибридизированногосрассеянным повтором Alu, который представлен более чем миллионом копий в геномечеловека(см.рис.5.75).Понеизвестнымпричинамэтипоследовательностигруппируютсявобластяххромосом,богатыхгенами.Наданной картине области, обогащенные последовательностями Alu — зеленые; области,обедненныеэтимипоследовательностями—красные,тогдакак областисихсреднимсодержанием—желтые.Каквидно,ДНКвблизи ядерной оболочки «обделена» областями, обогащенными генами. (За-
имствовано из A. Bolzer et al., PLoS Biol. 3: 826–842, 2005. С разрешения PublicLibraryofScience.)
Рис.4.65.Влияниевысокихуровнейэкспрессиигеновнавнутриядернуюместнуюлокализациюхроматина.
а)Флуоресцентныемикрофотографииядерклетокчеловекапоказывают,какположениегенаизменяется,когдаонначинаетэффективнотранскрибироваться.Областьхромосомы,смежнаясгеном(красный),какзаметно, покидаетсвоюхромосомнуютерриторию(зеленую)толькотогда,когдагенвысокоактивен.б)Схематичное представлениебольшойпетлихроматина,котораяразворачивается,когдаген«включен»,истягивается,когда этотген«выключен».Какпоказываюттежесамыеметоды,остальныегены,которыеэкспрессируютсяменее активно,остаютсянасвоейхромосомнойтерриториивовремятранскрипции.(ЗаимствованоизJ. R. Chubb andW. A. Bickmore,Cell112:403–406,2003.СлюбезногодозволенияиздательстваElsevier.)