Методы исследования в медицинской бактериологии

211

метод молекулярной гибридизации используется при идентификации трудно культивируемых или медленно растущих микробов (представителей родов

Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter).

Метод молекулярной гибридизации требует большого количества молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой чувствительностью и широкого практического применения не нашел.

Молекулярная гибридизация проводится в растворах, в тканевых срезах, на микрочипах (эррей гибридизация) и на мембранах. Наиболее распространенной является гибридизация на мембранах. Для этого исследуемую ДНК с помощью рестриктаз разрезают на мелкие фрагменты, которые фиксируют на мембране. Фрагменты наносят в виде точек (дот-блоты) или в виде полосок (слот-блоты). Затем к фрагментам ДНК добавляют специфические меченые зонды. Гибридизацию проводят при температуре 65ОС. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляются промыванием. В месте связывания зонда регистрируют флюоресценцию или изменение цвета.

11.4. Полимеразная цепная реакция

Полимеразная цепная реакция (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR)

позволяет обнаруживать геном возбудителя в исследуемом материале без выделения чистой культуры. Метод амплификации ДНК (многократного увеличения числа копий специфического фрагмента нуклеиновых кислот) в пробирке разработал в 1983 г. американский биохимик К. Муллис. За разработку метода ПЦР он в 1993 г. получил Нобелевскую премию по химии.

Суть ПЦР состоит в циклическом удвоении (амплификации) определенного участка ДНК с помощью специфических праймеров (затравок) и особых ферментов (полимераз). На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. В результате амплификации образуется множество копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о. В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать уникальные гены, характерные только для данного вида бактерий.

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие синтетические олигонуклеотиды – праймеры, комплементарные концам известного уникального фрагмента генома возбудителя. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку на обеих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3'-концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезируется копия ДНК. Синтез ДНК протекает только на участке между праймерами.

Каждая стадия происходит при определенной температуре. Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух новых нитей в следующем цикле амплификации. Переход от одной стадии к другой достигается изменением температуры инкубационной смеси. При многократном (30-40 раз) повторении этих циклов и оптимальном сочетании компонентов

212

реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества ампликонов. При наличии в исследуемом образце даже одной молекулы нуклеиновой кислоты образуется достаточное количество ДНК, которое можно выявить физико-химическими методами.

Исследуемый материал для ПЦР: соскобы эпителиальных клеток, кровь, плазма и сыворотка крови, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота, слизь и другие биологические выделения, биоптаты тканей. Забор материала проводится с помощью стерильного, желательно одноразового, инструментария в одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки, обработанные предварительно хромовой смесью, промытые дистиллированной водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150ОС в течение 1 часа.

Отобранные образцы могут храниться при комнатной температуре не более 2 часов. При необходимости пробы можно хранить в холодильнике при температуре 2-8ОС не более суток. Более продолжительное хранение (до 2 недель) возможно в морозильной камере при температуре минус 20ОС. Не допускается повторное замораживание – оттаивание проб.

Полимеразная цепная реакция включает в себя несколько этапов.

1.Подготовка пробы биологического материала (выделение ДНК из образцов). Суть этого этапа заключается в экстракции ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения чистого препарата ДНК, пригодной для амплификации. Метод выделения ДНК зависит от вида исследуемого материала. Чаще всего ДНК выделяют методом твердофазной сорбции. Для этого биоматериал обрабатывают лизирующим раствором, содержащим гуанидин изотиоцианат, для денатурации белков и высвобождения ДНК. Затем ДНК адсорбируют на сорбентах, многократно отмывают сорбенты от остатков лизирующего раствора и смывают нуклеиновую кислоту с сорбента буферным раствором.

При обработке сыворотки, плазмы или цельной крови используют метод фенольной экстракции. Этот метод включает депротеинизацию фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом.

2.Приготовление реакционной смеси. Компоненты реакционной смеси вносят микропипеткой в микропробирку, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации.

Компонентами ПЦР являются:

- материал, содержащий искомую ДНК возбудителя - ДНК-матрица; - смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов);

- ДНК-полимераза (Taq-полимераза), катализирующая полимеризацию ДНК; - два синтетических праймера (искусственно созданные затравки одноцепочечной ДНК длиной 18-30 оснований), комплементарные концам

требуемого конкретного фрагмента ДНК возбудителя; - специфический буфер, содержащий ионы магния, некоторые соли и

имеющий определенное значение рН.

Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) является “строительным материалом”, который использует Taq-полимераза для синтеза второй цепи ДНК. В

213

смесь входят дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).

Taq-полимераза является термостабильным ферментом, обеспечивающим достраивание 3'-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности. Этот фермент выделен из Thermophilus aquaticus. Кроме Taq-полимеразы в ПЦР применяют Pfu-полимеразу (выделена из Pyrococcus furiosus), Pwo-полимеразу (выделена из Pyrococcus woesei) и другие ферменты.

Праймеры представляют собой пару искусственно синтезированных олигонуклеотидов, имеющих размер от 15 до 30 п. н., идентичных соответствующим участкам ДНК-матрицы. Праймеры получают, исходя из известных генов возбудителей в специальных аппаратах – синтезаторах. Для получения праймеров необходимо знание нуклеотидной последовательности микроорганизмов. Для проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен одной из цепей ДНК. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.

Буфер содержит смесь катионов и анионов в определенных концентрациях, обеспечивающих оптимальные условия для реакции.

Во избежание испарения реакционной смеси в пробирки добавляют высококипящее вазелиновое масло или используют амплификатор с подогревающейся крышкой.

Основные исходные компоненты ПЦР представлены на рисунке 217.

Рисунок 217 – Исходные компоненты ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

3. Проведение амплификации ДНК (собственно ПЦР). При проведении ПЦР выполняются 25-30 циклов амплификации (термоциклирования), каждый из которых состоит из трех стадий.

3.1.Денатурация (плавление ДНК) протекает при температуре 93-95ОС в течение 30-40 секунд. В результате этого разрушаются водородные связи между двумя цепями ДНК, молекула ДНК “расплетается” и образуются одноцепочечные фрагменты. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев реакционной смеси в течение 2-5 минут для полной денатурации матрицы и праймеров. Такой прием называется горячим стартом.

3.2.Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 5065ОС. Время отжига составляет 20-60 секунд. На этой стадии праймеры присоединяются к комплементарным участкам ДНК-мишени с образованием дуплексов. Праймеры подбираются таким образом, что они ограничивают

214

(фланкируют) искомый фрагмент ДНК и комплементарны противоположным цепям ДНК. Участок ДНК-матрицы, с которым связывается праймер, должен быть уникальным только для данного возбудителя.

3.3. Элонгация (достраивание цепей ДНК). На этой стадии ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь от 3׳-конца праймера, который связался с матрицей. Температура элонгации обычно составляет 70-72ОС. Время элонгации составляет 20-40 секунд.

В дальнейшем новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов амплификации, и количество ампликонов с каждым циклом увеличивается в геометрической прогрессии (рисунок 218).

Рисунок 218 – Экспоненциальное накопление копий ДНК в ходе ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Поэтому за 30 циклов количество ампликонов, полученных из одной молекулы ДНК, достигает примерно 230 копий участка ДНК.

4. Детекция (визуализация ампликонов) производится несколькими способами:

-электрофоретическая детекция в агарозном или полиакриламидном геле;

-гибридизационно-ферментная детекция;

-гибридизационно-флуоресцентная детекция (регистрация продукта после окончания реакции амплификации – “анализ по конечной точке” и детекция продукта в режиме “реального времени”).

Наиболее распространенным до недавнего времени был метод горизонтального электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по размеру в агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием. Для выявления ДНК проводили электрофорез в агарозном геле, содержащем флюоресцирующий в УФ-свете бромид этидия. После электрофореза гель извлекали из электрофоретической камеры и переносили на столик трансиллюминатора (источника УФ-света), где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в УФ-свете (оранжевое свечение).

В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса.

215

В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в отрицательном контроле свидетельствует о контаминации (загрязнении) пробы.

Гибридизационная детекция проводится с использованием олигонуклеотидных зондов, содержащих метку (флуорофоры или интеркалирующие красители).

ПЦР проводится в амплификаторе (термоциклере) – приборе, который обеспечивает автоматическое периодическое охлаждение и нагревание пробирок с реакционной смесью (рисунок 219). Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются автоматически в соответствии с заданной программой.

Рисунок 219 – Амплификатор для проведения ПЦР. Заимствовано из Интернетресурсов.

Схема ПЦР представлена на рисунке 220.

95 С Денатурация

Образец ДНК Праймеры Нуклеотиды

Taq-полимераза Буфер Пробирка

72 С Элонгация

Термоциклер

Рисунок 220 – Схема ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

216

Полученные результаты можно документировать, фотографируя электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра (рисунок 221).

Рисунок 221 – Источник тока и камера для электрофореза. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Существуют автоматизированные системы визуализации гелей, включающие трансиллюминатор, видеокамеру и компьютер.

В настоящее время разработаны методы ПЦР для выявления многих бактерий (микобактерии, хламидии, микоплазмы, сальмонеллы, легионеллы и др.) и вирусов (ВИЧ, вирусы герпеса, цитомегаловирус, вирусы папилломы, вирус краснухи и др.).

Преимущества ПЦР перед другими методами диагностики инфекционных заболеваний:

-прямое определение наличия возбудителей (выявление участка ДНК конкретного возбудителя);

-высокая специфичность (выявление уникального фрагмента ДНК, характерного только для данного возбудителя);

-высокая чувствительность (присутствие в пробе 10-100 микробных клеток);

-универсальность процедуры выявления различных возбудителей;

-высокая скорость получения результатов анализа (4-5 часов);

-возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций (диагностика трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм микроорганизмов).

Ограничения метода ПЦР:

-амплификация ДНК как живых, так и погибших микроорганизмов;

-возможность перекрестной реакции и ложноположительных результатов;

-изменчивость микроорганизмов.

Различают несколько разновидностей ПЦР.

1. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, Real-time PCR, RT-PCR) позволяет отслеживать накопление ампликонов непрерывно в ходе реакции по флюоресценции зондов и не требует проведения электрофореза. Для проведения ПЦР-РВ в реакционную смесь добавляется специфический флуоресцентный зонд (например,

218

meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. В мультиплексной ПЦР используются меченые флуорофорами пробы. Для каждого возбудителя проба помечена определенным красителем, что позволяет дифференцировать ампликоны.

4.ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, Reverse Transcription PCR, RT-PCR) используется для выявления РНК-содержащих вирусов путем синтеза на матрице вирусной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной транскриптазы или ревертазы) комплементарной ДНК, которую в последующем применяют в качестве матрицы в стандартной ПЦР.

В качестве праймеров используют случайные (рэндом) праймеры, состоящие из 6 нуклеотидов. Такие праймеры могут использоваться обратной транскриптазой. Обратная транскрипция проводится при стабильной температуре 37ОС. Праймеры связываются с молекулами РНК, после чего обратная транскриптаза достраивает комплементарную цепочку ДНК. Причем, обратной транскрипции подвергаются все виды РНК, присутствующие в реакционной смеси.

В качестве праймеров используются также олиготимидиновый праймер. Такой праймер не связывается с клеточными рибосомными и транспортными РНК, что позволяет избавиться от значительной части балластной РНК.

5.Гнездовая (“вложенная”) ПЦР (Nested PCR) осуществляется последовательно с двумя парами праймеров (ДНК продукты, образуемые в реакции

спервой парой праймеров, используют для последующего взаимодействия со второй парой праймеров). Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.

6.ПЦР с использованием произвольных праймеров, ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК (ПП-ПЦР, Random Amplification of Polymorphic DNA PCR, RAPD-PCR) основана на использовании коротких праймеров, способных связываться с разными участками ДНК. В результате этого происходят амплификации нуклеотидных последовательностей в различных областях генома с образованием многочисленных фрагментов разной длины, по количеству и размерам которых судят о групповой или видовой принадлежности микроорганизма. Указанная ПЦР используется при необходимости отличить близкие по генетической последовательности организмы.

7.Широкодиапазонная ПЦР предусматривает использование универсальных праймеров, взаимодействующих с высоко консервативными участками ДНК, встречающимися у многих микроорганизмов (например, гены, кодирующие рибосомы 16S и 23S). В частности, широкодиапазонную ПЦР применяют для выявления в клиническом материале неизвестных и некультивируемых микроорганизмов.

8.“Инвертированная” ПЦР (Inverse PCR) используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов (лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.

9.“Ассиметричная” ПЦР (Asymmetric PCR) проводится тогда, когда нужно амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в

219

некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в большом избытке.

10.Ступенчатая ПЦР (Touchdown или Stepdown PCR) позволяет уменьшать влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.

11.ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) является модификацией ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и больше). Используют 2 полимеразы, одна из которых – Taq-полимераза с высокой процессивностью (то есть способная за один проход синтезировать длинную цепь ДНК), а вторая – ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.

11.5.Лигазная цепная реакция

Воснове метода лежит способность специфического фермента ДНКзависимой ДНК-лигазы сшивать цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов магния при наличии разрыва фосфоэфирной связи. Используется термостабильная лигаза и 4 специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке. Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу, одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После денатурации ДНК-матрицы при 95ОС олигонуклеотиды связываются специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50ОС. Далее эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов. Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов применяют 2 метки: биотин на одном конце и флуоресцеин – на другом конце лигированных олигонуклеотидов. В последующем фрагменты связываются антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета. Антибиотиновые антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, также количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и после добавления субстрата дают окрашенный продукт.

11.6. Секвенирование

Секвенирование представляет собой метод, позволяющий определять последовательность нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина) в молекуле ДНК. Цели секвенирования:

220

-расшифровка генома – определение количества генов, их протяжённости, локализации, функций;

-идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения нуклеотидной структуры некоторых их генов с соответствующими последовательностями известных видов;

-определение мутаций в генах для выявления резистентных микроорганизмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости;

-эпидемиологические исследования (определение генетических различий штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников для определения связей между циркулирующими в различных регионах и стационарах микроорганизмов);

-оценка сходства микроорганизмов и их происхождения.

Методика секвенирования. Готовят реакционную смесь, состоящую из изучаемой ДНК, праймера, ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов (дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), меченых флюоресцентной меткой дидезоксинуклеотидов. Затем проводят ПЦР, позволяющую получить множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000 нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в один нуклеотид. После этого очищают амплифицированные фрагменты ДНК от остатков ПЦР (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов) и проводят электрофорез в полиакриламидном геле для разделения фрагментов ДНК, отличающихся в один нуклеотид. Результатом секвенирования является первичная структура секвенированного фрагмента ДНК, которую идентифицируют с помощью компьютерных программ.

Другие варианты секвенирования.

Крупномасштабное секвенирование, позволяющее секвенировать большие фрагменты ДНК, например, целую хромосому микроорганизмов. ДНК нарезают на фрагменты при помощи рестриктаз. Эти небольшие фрагменты при помощи вектора переносят в Escherichia coli (клонируют). Микроорганизмы, размножаясь, приводят к накоплению клонированной ДНК (клональная амплификация). Далее все разновидности клонированных фрагментов ДНК секвенируют и при помощи компьютера собирают в единую длинную цепочку. Такой подход не требует предварительной информации об изучаемой ДНК, поэтому относится к секвенированию de novo.

Секвенирование с использованием гибридизации. В его основу положены гибридизационные биочиповые технологии. При этом неизвестная ДНК обрабатывается флюоресцентным красителем и наносится на чип с большим количеством зондов разной специфичности, находящихся в разных участках чипа. Тот участок чипа, где отмечается сильная флюоресценция, свидетельствует о комплементарности зонда и изучаемой ДНК, что позволяет идентифицировать ДНК, зная характер зонда.

Микрожидкостное секвенирование по Сенджеру. Проводится с использованием всех стадий секвенирования по Сенджеру: ПЦР, очистки продуктов амплификации, электрофореза. Реакция осуществляют в специальных чипах, при этом объем реакции измеряется в нанолитрах, что способствует меньшему расходу