Методы исследования в медицинской бактериологии

Для идентификации выделенных культур по биохимическим свойствам в состав питательных сред вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие индикаторы. В качестве субстратов используют углеводы (глюкоза, сахароза, лактоза и др.), белки, липиды, мочевину и другие соединения. При расщеплении субстратов изменяется рН среды или окислительно-восстановительный потенциал среды. В результате этого индикатор изменяет цвет среды или вокруг колоний бактерий формируются специфические зоны расщепления субстратов.

Для определения пути расщепления глюкозы (окислительный или бродильный) проводят тест ОФ (тест окисления/ферментации): культуру высевают уколом в две пробирки с полужидкой питательной средой, содержащей глюкозу и бромтимоловый синий. Исходный цвет среды – зеленый. В одну из пробирок после посева наносят слой вазелинового масла (для создания анаэробных условий). Обе пробирки инкубируют при температуре 37°С. Изменение цвета среды на желтый в обеих пробирках свидетельствует о ферментации глюкозы. Изменение цвета среды только в пробирке без масла свидетельствует об утилизации глюкозы путем окисления. Отсутствие кислотообразования в обеих пробирках и сохранение исходного цвета свидетельствует о том, что тестируемые микроорганизмы не утилизируют глюкозу ферментацией и окислением. В этом случае микроорганизмы могут относиться к неферментирующим видам (рисунок 118).

ьно-

При посеве в жидкое молоко протеолиз выражается просветлением столбика молока, водянистым содержимым и слизистым осадком на дне.

Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и аммиак. Для обнаружения этих газообразных продуктов используют индикаторные бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватномарлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана)

126

Липолитическую активность бактерий определяют на агаре с водным раствором твина разной концентрации (твин 80, 40 или 20). На поверхность агара с твином высевают штрихом исследуемый микроорганизм. О наличие липазы судят по образованию вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей жирных кислот, освобожденных из твина.

Редукция нитратов (денитрификация) - способность микробов восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты), а затем в аммиак и свободный азот. Редукцию нитратов определяют посевом на специальную среду, состоящую из МПБ и 2% азотнокислого калия (калийная селитра). После внесения исследуемой культуры посевы инкубируют в течение 48-72 часов при температуре 37-38°С. Затем добавляют 1 мл реактива, содержащего йодистый калий и серную кислоту. При редукции нитратов в нитриты проявляется темно-синее окрашивание среды.

На питательных средах (in vitro) можно определить некоторые свойства бактерий, характеризующие их патогенность: гемолиз эритроцитов, наличие лецитиназы и др.

Определение гемолитических свойств производят путем посева культуры на МПА, содержащий 5% дефибринированной крови (кровяной агар). При росте на кровяной среде микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами, вокруг колонии в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (β- гемолиз) или зона, окрашенная в зеленоватый цвет (α-гемолиз). Разные виды гемолиза на кровяном агаре представлены на рисунке 125.

Рисунок 125 – Виды гемолиза на кровяном агаре. Заимствовано из Интернетресурсов.

В жидких питательных средах с кровью при гемолизе среда делается прозрачной (красная лаковая кровь).

Наличие лецитиназы определяется на средах, содержащих желток куриного яйца, содержащего большое количество лецитина. Под действием бактериальной лецитиназы лецитин питательной среды подвергается гидролизу с отложением вокруг микробных колоний продуктов распада в виде отчетливой зоны опалесценции (рисунок 126).

127

Рисунок 126 – Выявление лецитиназы на желточном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Тест на дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) применяют для дифференциальной диагностики и идентификации S. aureus, S. marcescens и других бактерий. Посев исследуемой культура производят бляшками или штрихом. Посевы инкубируют при температуре 36ОС в течение 20-24 часов. Затем в чашку вносят 5 мл 0,1N раствора соляной кислоты на 3-5 минут. Раствор сливают. При положительном результате на фоне мутной от осадка среды (взаимодействие высокомолекулярной ДНК с хлоридом натрия) вокруг посева образуется прозрачная зона деполимеризованной ДНК (рисунок 127).

Рисунок 127 – Выявление бактериальной ДНКазы у золотистого стафилококка (указано стрелкой) при посеве штрихом. Справа – отрицательный контроль.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Тест на плазмокоагулазу и фибринолизин проводится в пробирке,

содержащей плазму крови кроликов, в которую вносят исследуемую культуру. Результаты учитывают через 1, 2 и 4 часа инкубирования посевов в термостате при температуре 36ОС. При положительном результате через 2-4 часа жидкость превращается в сгусток, который не разрушается при легком встряхивании пробирки. При дальнейшем выдерживании такой пробирки при комнатной

128

температуре наблюдается растворение сгустка под действием фибринолизина (рисунок 128).

Рисунок 128 – Действие плазмокоагулазы (свертывание плазмы, верхняя пробирка) и фибринолизина (разжижение сгустка, нижняя пробирка) на плазму крови.

Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Ферменты, обусловливающие сахаролитические и протеолитические свойства, часто встречаются у представителей разных видов бактерий. Поэтому дифференцирующие свойства традиционных схем идентификации бактерий относительно невысокие. Для более четкой дифференциации культур необходимо определять у них родо- и видоспецифические ферменты.

Классические пробирочные тесты при исследовании биохимической активности бактерий сохраняют свое значение и в настоящее время. Но эти тесты трудоемки и требуют больших временных и материальных затрат. Особое значение пробирочные тесты имеют в период внедрения новых тест-систем для идентификации бактерий, при анализе деятельности лабораторий и отдельных специалистов в ходе лицензирования и сертификации.

5.2.5. Микротест-системы для идентификации бактерий

Дифференциация и идентификация бактерий предусматривает установление родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов. Эти исследования составляют основную часть культурального метода. Продолжительность культурального классического пробирочного метода для выдачи окончательного результата, особенно с учетом определения чувствительности культуры к антимикробным препаратам, составляет от 4 до 10 дней в зависимости от вида возбудителя. Международные стандарты ориентируют методы культурального исследования на срок 48-72 часа (в идеале – первые сутки после получения клинического материала на исследование). Поэтому важным направлением культурального исследования является разработка ускоренных методов идентификации бактерий.

Сокращение сроков идентификации чистой культуры и объемов

культурального исследования возможно при использовании биохимических тест-

129

систем (миниатюризированных систем идентификации бактерий или СИБ, а также специальных коммерческих наборов для ускоренной идентификации). Биохимические тест-системы выпускаются в виде пластин, полосок, стрипов, слайдов, планшетов. Такие тест-системы представляют собой панели или полистироловые планшеты с сухими дифференцирующими средами. В основе этих тест-систем лежат модификации классических пробирочных биохимических методов. Подобные тест-системы позволяют одновременно изучать 20, 32, 64 биохимических признака. В работе с тест-системами необходимо использовать только чистую культуру бактерий. Так как в таких системах используются малые объемы субстратов и культуры, то такой метод часто называют микрообъемной биохимической идентификацией.

Биохимические тест-системы выпускаются разными отечественными и зарубежными фирмами: АО “Аллерген”, Ставрополь; НИИЭМ, Нижний Новгород; НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург; PLIVA-Lachema, Чехия; bioMerieux, Франция; Dade, США и др. Фирмы-производители предлагают тест-системы для биохимической идентификации энтеробактерий, стафилококков, неферментирующих грамотрицательных бактерий, стрептококков, энтерококков и других групп бактерий. Кроме тест-систем производители выпускают диагностические полоски и диски для предварительной идентификации некоторых бактерий (например, диски с оптохином для предварительной идентификации S. pneumoniae), для определения некоторых признаков бактерий (например, ОКСИтест для выявления бактериальной цитохромоксидазы, ОНПтест для обнаружения бетагалактозидазы).

Тест-системы, позволяющие одномоментно определять большое количество признаков, подразделяются на следующие группы:

-системы с бумажной основой (СИБ, Имбио, Micro-ID, Patho-Tec, spot-test system и др.);

-системы с высушенными или замороженными субстратами в микроемкостях в виде специальных планшетов (ПБДЭ, ПБДС, ДС-ДИФ-ЭНТЕРО- 12, API, API 20E, API-Staph-system и др.);

-автоматизированные системы с плотными пластическими средами

(Repliscan, Enteric Tec system, MicroScan-system и др.);

-автоматизированные системы для идентификации и экспрессного выявления чувствительности к антибиотикам (AMS, MS-2, Autobac, AMS GPI и др.).

Пластины биохимические дифференцирующие ПБДЭ для энтеробактерий

иПБДС для стафилококков (НИИЭМ, Нижний Новгород) являются заменой классических пробирочных методов. Они содержат лиофилизированные питательные среды с субстратами. В них вносится небольшое количество суспензии исследуемых культур. Они позволяют минимизировать объем используемых культур при большом количестве тестов, визуально оценивать результаты по изменению окраски сред в лунках, сократить время исследований (рисунок 129).