Методы исследования в медицинской бактериологии

201

связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя одну линию на тест-полоске.

Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных соединений – вирусов, различных гормонов (например, в тестах на беременность), возбудителей бактериальных инфекций.

Метод конкурентого ИХА, используемый для определения низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и иммобилизованного конъюгата аналит-белок-носитель за ограниченное количество центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате “антителометка”. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом “антитело-метка” на мембране. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую зону, где иммобилизован конъюгат “аналит-белок-носитель”. Иммунокомплекс не может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений: низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и, соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже занят аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела, находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его пороговое значение для данного теста.

При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат “антителометка” связывается с конъюгатом “антиген-белок-носитель”, иммобилизованным в зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат “антитело-метка” попадает в зону контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом, наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным результатом анализа.

Формат конкурентного ИХА используется для выявления низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.

Преимуществом метода является быстрота и легкость его применения. В этом методе не требуется использование сложного оборудования, и анализ может быть проведен неспециалистом в любых условиях, в том числе в “полевых”.

Существуют также приборные полуколичественные и количественные форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.

В качестве меток в ИХА используются следующие вещества:

1.Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование). Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса, позволяет проводить мультианализ, в котором линии разного цвета соответствуют различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы коллоидного золота.

2.Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминесцентные метки,

ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в

202

приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.

3.Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса). Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих силу магнитного поля.

4.Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА. Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.

Иммунохроматографические тесты выпускаются для конкретных целей. Например, обнаружение гемолизина BL и негемолитического энтеротоксина NHE B. cereus в пищевых продуктах осуществляют с помощью иммунохроматографического экспресс-теста Duopath® Cereus Enterotoxin (рисунок 207).

Рисунок 207 - Иммунохроматографический экспресс-тест Duopath® Cereus Enterotoxin для обнаружения энтеротоксинов B. cereus в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для предварительного выявления сальмонелл в пищевых продуктах применяют экспресс-тест Singlepath® Salmonella – иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител. При наличии в пробе антигена (сальмонелл) образуется четкая красная линия (рисунок 208).

а б Рисунок 208 – Положительный (а) и отрицательный (б) результаты экспресс-теста

Singlepath® Salmonella. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

203

В настоящее время в диагностику сифилиса активно внедряется

иммунохроматографический анализ, позволяющий определять антитела к антигенам T. pallidum, иммобилизированным на мембране (тест-полоске). Этот тест позволяет провести диагностику сифилиса в домашних условиях (рисунок 209).

Рисунок 209 – Набор “Иммуно Хром-анти ТР-Экспресс” для экспресс-диагностики сифилиса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Для выявления кампилобактерий в пищевых продуктах фирма Merck (Германия) выпускает экспресс-тест Singlepath-Campylobacter, представляющий собой иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител (рисунок 210).

Рисунок 210 - Экспресс-тест Singlepath-Campylobacter для обнаружения кампилобактерий в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

В иммунохроматографических тестах исследуемый материал вносится в круглую лунку, где антиген адсорбируется подложкой и часть его взаимодействует с меченными антителами. Комплекс “антиген+антитело” мигрирует в тестовую зону (Т), где связывается с антителами к этому комплексу. В результате взаимодействия образуется четкая красная полоса. Оставшаяся часть образца мигрирует далее в контрольную зону (С), где образует четкую красную полосу, указывающую на специфичность теста.

204

9.12.Феномен набухания капсулы

Вначале ХХ века немецкий бактериолог Ф. Нейфельд впервые с помощью типоспецифических антисывороток разделил пневмококки на серотипы. В настоящее время в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов описано более 90 серотипов пневмококка. Для серотипирования пневмококков Ф. Нейфельд использовал метод набухания капсулы: при добавлении к взвеси бактерий противокапсульной сыворотки, содержащей антитела против капсульных полисахаридов данного серотипа пневмококков, происходит резкое увеличение (набухание) капсулы, которое хорошо видно при фазово-контрастном микроскопическом исследовании (рисунок 211).

а б Рисунок 211 – Реакция набухания капсулы по Нейфельду: а - отрицательная

реакция, б – положительная реакция (Алябьева Н.М., 2014 г.).

Реакция набухания капсулы (реакция Нейфельда, quellung reaction) остается основным методом серотипирования пневмококков и считается “золотым стандартом” дифференцировки пневмококков.

9.13. Реакция бактериолизиса

Реакция бактериолизиса проявляется растворением бактерий в результате взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие лизис бактерий, называются бактериолизинами. В пробирочных тестах применяют иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при температуре 37ОС в течение 30 минут, что приводит к разрушению комплемента.

Для проведения реакции в опытную пробирку вносят 0,5 мл разведенной 1:10 инактивированной иммунной сыворотки, добавляют 0,1 мл взвеси живых микробов (концентрация – 1 млрд. микробных клеток в 1 мл) и 0,1 мл комплемента. Во вторую пробирку вносят только иммунную сыворотку и микробную взвесь. В третью пробирку вносят только взвесь микробов и комплемент. Затем во все пробирки добавляют изотонический раствор хлорида натрия, доводя объем до 2 мл.

Пробирки помещают в термостат при температуре 37ОС на 2 часа. После инкубации производят высев из всех пробирок в чашки Петри с плотной питательной средой. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37ОС в

205

течение 18-24 часов и подсчитывают количество выросших колоний. Число выросших колоний из опытной пробирки должно быть в десятки и даже сотни раз меньше, чем из контрольных пробирок.

206

10. Аллергологическая диагностика

Особое место в диагностике инфекционных болезней принадлежит внутрикожным пробам с бактериальными аллергенами. В таблице 23 представлены некоторые диагностикумы, применяемые в аллергологических исследованиях.

Таблица 23 – Диагностические внутрикожные пробы

Примечание: “+” - положительная реакция; “++” - резко положительная реакция; “-“ - отрицательная реакция.

Внутрикожные пробы в основном используются с диагностической целью. Они позволяют выявлять в организме антитела или сенсибилизированные к аллергену Т-лимфоциты. Кожно-аллергические реакции при инфекционных заболеваниях появляются с 4-5 дня болезни и достигают наибольшей интенсивности на 2-3 неделе болезни.

Аллерген вводят внутрикожно или наносят на скарифицированную кожу. У больного, сенсибилизированного к данному возбудителю, на месте введения аллергена через 24-48 часов развивается воспалительная реакция (положительный результат).

Проба Манту проводится путем внутрикожного введения туберкулина в объеме 0,1 мл. Туберкулин вводят строго внутрикожно на внутреннюю поверхность средней трети предплечья до образования “пуговки”. Суть реакции Манту состоит в том, что вводимые фрагменты микобактерий как бы притягивают к себе из кровеносных сосудов лимфоциты, уже встречавшиеся с туберкулезными бактериями. Чем больше в организме таких лимфоцитов, тем интенсивнее будет воспаление (положительная реакция). Результаты пробы учитывают через 48-72 часа по наличию индурации – очерченного или расплывчатого уплотнения тканей или образования папулы (рисунок 212).

Проба Манту оценивается следующим образом:

-отрицательная - наличие реакции от укола до 2 мм в диаметре;

-сомнительная - папула диаметром 2-4 мм или гиперемия;

207

-положительная - папула диаметром 5-17 мм у детей и подростков и 5-21

мму взрослых;

-гиперэргическая - папула диаметром более 17 мм у детей и подростков и более 21 мм у взрослых.

Рисунок 212 – Проведение пробы Манту и учет результатов. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

Однако проба Манту дает положительную реакцию у людей, привитых вакциной БЦЖ. Кроме того, с помощью реакции Манту нельзя провести границу между инфицированием и латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ). Поэтому до последнего времени остается актуальным вопрос дифференцировки поствакцинальной (Mycobacterium bovis, штамм БЦЖ) и постинфекционной (Mycobacterium tuberculosis) чувствительности к туберкулину.

Определенную помощь в решение этого вопроса оказывает Диаскинтест. В основе этого теста лежит использование для внутрикожного введения синтетических белков, характерных исключительно для возбудителя туберкулеза (Mycobacterium tuberculosis). Положительная проба Манту означает, что человек либо контактировал с возбудителем туберкулеза, либо недавно получил прививку БЦЖ, либо его организм инфицирован непатогенными микобактериями. Диаскинтест дает положительный результат только в том случае, когда человек инфицирован возбудителем туберкулеза или уже болеет туберкулезом (рисунок

213).

Рисунок 213 – Результаты Диаскинтеста через 72 часа. Заимствовано из Интернетресурсов.

208

Аллергеном для постановки пробы Бюрне служит бруцеллин, представляющий собой 0,1%-ный раствор полисахаридно-белкового комплекса, полученного из вакцинного штамма B. abortus 19-ВА. Применяется для выявления аллергической перестройки у инфицированных, больных, переболевших и лиц, вакцинированных против бруцеллеза. Вводится в дозе 0,1 мл внутрикожно в сгибательную поверхность предплечья. Реакция оценивается через 24 и 48 часов по размеру отека:

-диаметр отека 1-3 см – реакция слабо положительная;

-отек размером 3-6 см – умеренно выраженная реакция;

-отек более 6 см – сильно выраженная реакция.

Внутрикожное введение аллергена у больного бруцеллезом вызывает развитие местной реакции (отек, гиперемия, болезненность). Отрицательная проба Бюрне позволяет исключить бруцеллез. Положительная реакция Бюрне отмечается у больных и вакцинированных лиц (рисунок 214).

Рисунок 214 – Внутрикожная аллергическая проба Бюрне при бруцеллезе. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

210

11.2. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ

Сущность рестрикционно-эндонуклеазного анализа заключается в обработке ДНК рестриктазами (эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по определенным последовательностям нуклеотидов. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ (REA) предусматривает обработку рестриктазами ДНК бактериальной хромосомы. После разрезания ДНК проводят электрофорез в пульсирующем электрическом поле, в результате чего образующиеся фрагменты ДНК распределяются в зависимости от размера в уникальный видоспецифический профиль (рисунок 216). По сходству рестрикционных профилей изучаемого микроба и известных видов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы.

Рисунок 216 – Пример рестрикционно-эндонуклеазного анализа бактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.

11.3. Молекулярная гибридизация

Молекулярная гибридизация основана на определении уникальных последовательностей генома микроорганизмов, отражающих свойства вида или варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. В исследованиях используют меченые ферментом, радионуклидом или флюорохромом нуклеиновые зонды, представляющие однонитевые фрагменты ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Образующиеся гибридные комплексы выявляются по изменению окраски реакционной смеси, флюоресценции или радионуклидным анализом.

Молекулярная гибридизация позволяет выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов. В основном