диссертации / 81

181

Сейчас, принято рассматривать РФ и АЦБ как различные системы аутоантител и соответственно, выделять два клинико-лабораторных субтипа РА (АЦБ-

позитивный и АЦБ-негативный), отличающихся по молекулярным механизмам патогенеза, тяжести течения и подходам к терапии [67, 77, 79, 82, 331, 332]. При раннем РА, больные серопозитивные по АЦБ, отличались от серонегативных только более высоким уровнем IgM РФ, а при РА, как IgM, так и IgA РФ. В целом при РА нами обнаружены достоверно большее количество ЧПС, ЧБС, более высокие значения DAS28, СОЭ и концентраций IgM/IgA РФ в группе АЦБ-

позитивных пациентов по сравнению с АЦБ-негативными. В данной работе у пациентов с РА изолированно обнаруживались только АМЦВ и АКА в 33% и 40%

случаев, соответственно. Следует отметить, что в “отрицательной” по IgM РФ группе АЦЦП, АМЦВ и АКА встречались в 34%, 48%, и 21% случаев, что подтверждает большую ДЧ АЦБ по сравнению с IgM РФ. Также, необходимот учитывать существование серонегативных по РФ вариантов данного заболевания,

при которых по нашим и зарубежным данным АЦЦП выявляется в 34%-38%

случаев. [10, 75, 64, 65, 316, 333].

Данные о способности РФ и АЦБ отражать воспалительную активность РА носят противоречивый характер. Аmri M. и совт. обнаружили достоверную взаимосвязь повышенного сывороточного содержания IgM-, IgA РФ, АЦЦП, АКА

182

с ЧПС и ЧБС, а IgM РФ с СОЭ [301]. Нами получены сходные данные о корреляции IgM РФ с ЧПС и АЦЦП с ЧБС при раннем РА. Кроме этого отмечена слабая взаимосвязь уровня СРБ с концентрациями IgM РФ, АЦЦП, АМЦВ при раннем РА и развернутом РА. Как в данном исследовании, так и в работах Аmri M. и совт. и Greiner A. и соавт. не удалось найти взаимосвязи концентраций аутоантител с значениями DAS28 [334]. Bas S. и соавт., напротив, обнаружили корреляцию данного индекса активности РА с уровнями IgA-, IgM РФ и АЦЦП

[70], a Alexiou I. и соавт. только с IgM РФ [335].

СРБ - классический острофазовый белок плазмы крови, рассматривающийся как наиболее чувствительный лабораторный маркер инфекции, воспаления и тканевого повреждения [90, 91]. Определение СРБ является более стабильным,

валидированным и воспроизводимым маркером воспаления, чем СОЭ [110]. Так,

степень корреляции уровня СРБ с данным показателем по нашим данным находилась в границах умеренных значений: (r=0,7-0,6) в зависимости от стадии РА. Определение СРБ может использоваться для оценки активности патологического процесса (является компонентом DAS28, SDAI), прогноза и тяжести деструктивного поражения суставов [108, 109]. Использование СРБ, а не СОЭ, при подсчете DAS28 позволяет более достоверно оценить активность заболевания [94]. Связь с активностью заболевания подтверждается полученными данными о корреляции уровня СРБ с DAS28 и ЧПС при РА. Однако нами не было обнаружено взаимосвязи между уровнем СРБ и такими показателями деструктивного поражения суставов как рентгенологическая стадия и общий счет

Sharp-van der Heijde. Отмечена корреляция слабая корреляция СРБ с наличием системных проявлений в развернутой стадии заболевания, что подтверждается наблюдениями Nyhäll-Wåhlin B.M. и соавт. [336].

Участвуя в патогенезе РА, кальпротектин усиливает протеолиз внеклеточного матрикса и аутоиммунные нарушения, индуцируя псевдоопухолевый фенотип синовиоцитов [95]. В синовиальной жидкости больных РА отмечается гиперпродукция данного белка [337]. Достоверная корреляция между кальпротектином, СОЭ и уровнем СРБ, обнаружена не только в данном

183

исследовании (r=0,3 и 0,6 соответственно), но и в работах Hammer H.B., Berntzen H.B. и Brun J.G. [338-340]. Показано, что кальпротектин может являеться независимым прогностическим маркером клинического и рентгенологического прогрессирования РА [338, 341]. Нами, как и в исследовании Hammer H.B. и

соавт. обнаружена взаимосвязь уровня кальпротектина с DAS28, но не с показателями рентгенологической деструкции суставов [338]. Таким образом,

изменения концентраций СРБ и кальпротектина в сыворотке крови могут отражать воспалительную и клиническую активность РА, при этом данных о взаимосвязи этих белков с показателями рентгенологической деструкции суставов не получено.

RANKL играет важную роль в ремоделировании костной ткани, принимая участие в процессах остеокластогенеза, миграции остеокластов и регуляции апоптоза [342]. Проостеокластогенная функция RANKL регулируется его рецептором - остеопротегерином (ОПГ), конкуренто подавляющим способность первого связываться с RANK [343]. Степень развития костной деструкции при РА зависит от баланса анти- и про-остеокластогенных факторов в регуляции соотношения которых важную роль играет RANKL. Так RANKL, связанный с мембраной остеобластов и секретируемый синовиоцитами активно вовлечен в процессы костной деструкции при РА [344-346]. В нашим исследовании отмечена

“средняя” степень корреляции уровней sRANKL и СРБ при раннем РА, что согласуется с работами Hein G. и соавт. и Geusens P. и соавт. [347, 348]. Степень описанной González-Alvaro I. и соавт. взаимосвязи между активностью заболевания и уровнем sRANKL (r=0,3) при РА, полностью соотносится с нашими данными [115]. Однако, в недавнем исследовании группы египетских авторов подобных взаимосвязей не обнаружено [349]. Согласно данным Geusens P. и

соавт. существует “слабая” корреляционная зависимость между уровнем RANKL

и степенью ренгенологической прогрессии, в частности с общим счетом Sharp-van der Heijde [348]. Однако более позднее исследование Syversen S. и соавт.

опровергают эти результаты [24] . В данной работе обнаружен только достоверно

184

более высокий уровень RANKL при 4 рентгенологической стадии РА по сравнению с 3-ей.

Уровень COMP может служить специфическим маркером деградации хряща при РА [114]. Попытки использовать его в качестве лабораторного маркера РА продемонстрировали неприемлемые для клинической практики значения ДЧ

(15%–48%) и ДС (66%–69%) [350]. Существуют данные о возможности применения данного биомаркера в качестве предиктора поражения крупных суставов, так как его уровень достоверно возрастает при агрессивных формах течения РА [351-353]. Кроме этого, показано, что высокий уровень CОМP,

коррелирует с рентгенологическими признаками суставной деструкции, что подтверждается и результатами данной работы [354]. Сывороточное содержание СOMP позволяет прогнозировать 5 летний риск развития тяжелого деструктивного поражения суставов [355, 356]. Данные о связи уровня COMP c

воспалительной активностью РА, носят противоречивый характер. В

исследованиях Saxne T. и соавт. и P. Roux Lombard и соавт. не обнаружено взаимосвязи данного показателя с уровнем СРБ и СОЭ, тогда как, результаты других авторов свидетельствуют об обратном [357-360]. Данные о способности

COMP отражать клиническую активность заболевания, также носят неоднозначный характер. Ряд публикаций свидетельствует о наличие связи его уровня с DAS28, в то тоже время исследование Marti C. и соавт. согласуясь с полученными в данной работе результатами, не подтверждают данную закономерность [359, 361363].

В нашей работе отмечена корреляция уровня ММП-3 с воспалительной активностью РА - уровнями СОЭ и СРБ в сыворотке крови, и не обнаружено взаимосвязи с развитием костной деструкции, согласуясь с результатами полученными японскими исследователями [364].

При РА в синовиальной мембране происходит резкое увеличение количества активированных B- и Т-лимфоцитов, тучных клеток, макрофагов, участвующих в неоваскуляризации и лимфоангиогенезе. Хронизация воспаления достигается за счет нарастания количества активированных в процессе хрящевой и костной

185

деструкции тканевых фибробластов, хондроцитов и остеокластов. Цитокины играют основную роль в рекрутинге, активации и осуществлении эффекторных функций клеток, участвующих в развитии аутоиммунного воспалительного процесса при РА [119].

В настоящее время существует несколько методов мультиплексного анализа цитокинов в сыворотке/плазме крови [365, 366]. В данной работе использовалась технология xMAP основанная на “сэндвич” методе ИФА, главным элементом которой является суспензия кодируемых микросфер содержащих молекулярные зонды, специфичные к одной из множества исследуемых биологических молекул

[367-371]. Данная технология обладает высоким аналитическими харакеристиками при определении концентрации цитокинов в сыворотке крови

[366].

При исследовании уровней цитокинов в сыворотке крови одной из причин искажения результатов исследований является присутствие в исследуемом материале гетерофильных антител, в частности IgM РФ, представляющего собой антитела к Fc-фрагменту IgG [372-374]. Влияние IgM РФ описано при применении планарных микрочипов, “in house” реагентов и использовании неразведенных образцов биологических жидкостей [375-378]. Существует ряд реагентов, позволяющих исключить влияние высокого содержания IgM РФ на результаты исследования, блокируя: HeteroBlock, heterophilic blocking reagent (HBR); immunoglobulin-inhibiting reagent (IIR) или удаляя IgM РФ: протеин-L, PEG6000, “ВектоРФ-иммуносорбент” [372, 374, 376, 379]. Представляется интересным, что даже при использовании PEG6000 эффективность удаления IgM

РФ составляет ≈50% для плазмы/сыворотки и ≈30% для синовиальной жидкости

[379]. В нашем исследовании использовались наборы реагентов “Bio-Plex Pro Human Cytokine Standard Group I 27-Plex” (Bio-Rad, США), где твердой фазой служили магнитные микросферы, а процедуры “отмывки” осуществлялись с применением промывочной станции Bio-Plex Pro II Wash Station, что приводит к существенной редукции неспецифического связывания исследуемых аналитов с гетерофильным антителами [380, 381]. Это подтверждается тем, что при

186

использовании аналогичных реагентов фирмы LINCO, где твердой фазой служат обычные полистироловые микросферы, содержащих специальный буфер для устранения влияния IgM РФ и наборов Bio-Rad, были получены сходные

результаты концентраций цитокинов [382].

При изучении степени влияния высоких концентраций IgM РФ на точность определения содержания цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости

(при разведении 1:4) методом xMAP нами отмечена достоверная корреляция уровня IgM РФ только c IL-9 (r=0,7) в сыворотке, при этом она сохранялась

(r=0,6) и при удалении данных аутоантител с использованием реагентов

“ВектоРФ-иммуносорбент”. Подобные результаты получены (разведения сыворотки крови 1/2, 1/20, 1/1000) и при использовании планарных микрочипов,

для создания иммунологического индекса активности РА, где, либо не отмечено интерференции с гетерофильными антителами и в частности с IgM РФ, либо ей можно пренебречь [383]. Следует отметить, что удаление/блокировка гетерофильных антител во всех выше перечисленных исследованиях приводили к значительному снижению определяемых уровней всех исследуемых биомаркеров.

Кроме этого в нашей работе показано, что после удаления IgM РФ, корреляции с прежними уровнями, сохранились лишь у части цитокинов. Kokkonen H. и соавт.

проводили удаление/блокировку IgM РФ из плазмы крови используя HeteroBlock

и протеин-L, согласно рекомендациям Raza K. и соавт. В результате показано, что

данные, полученные после использования этих реагентов, не поддаются

сопоставлению [212, 384]. В этой работе, методом “mismatch simplex sandwich”

убедительно показано отсутствие влияние IgM РФ на результаты исследований при использовании оригинальных реагентов “Bio-Plex Pro Human Cytokine Standard Group I 27-Plex”. Таким образом, при определении цитокинов в биологических жидкостях пациентов с РА технологией xMAP, использование магнитных микросфер, автоматизированной отмывки и большая степень разведения сыворотки приводят к кардинальному снижению влияния IgM РФ на результаты исследования.

187

В нашей работе показано наличие корреляционной зависимости между уровнями большинства исследуемых биомаркеров в синовиальной жидкости и сыворотке крови. K. Raza и соавт. [212] провели измерение уровня 23 цитокинов в синовиальной жидкости у 36 больных с ранним РА (< 6 мес.), 9 больных с РА (> 6

мес.), 12 больных подагрическим артритом и 4 больных ОА. Авторами показано транзиторное увеличение концентрации IL-2, -4, -13, -17, -15, основного FGF и

эпидермального фактора роста (ЭФР) у 8 больных ранним РА в течение первых 3

мес. после появления клинических симптомов заболевания и повышение уровня

IFN-γ у 14 больных с недифференцированным, псориатическим (ПСА) и другими вариантами неревматоидного персистирующего артрита на ранней стадии болезни. При РА в СЖ происходит увеличение продукции IL-17 CD4 T-клетками.

Th17 клетки при этом в большей степени продуцируют TNF-α [385].

В синовиальной жидкости при РА значительно повышаются уровни провоспалительных IL-1β, TNF-α; антивоспалительных: IL-1ra, -10; Th1: IL-2, IFN-γ; Th2: IL-4; Th17: IL-17 цитокинов, стромальных и ангиогенных факторов:

G-CSF, GM-CSF и хемокинов IL-8, IP-10, MCP-1. [386, 387]. Уровни цитокинов,

секретируемых Т-клетками, макрофагами и стромальными клетками (IL-2,-4,-13,- 17,-15, основного фактора роста фибробластов (FGF-2), эпидермального ростового фактора (EGF) и GM-CSF значимо повышаются в течении трех месяцев после начала заболевания.

В ходе прогрессирования РА в периферической крови происходит изменение уровней цитокинов принадлежащих ко всем основным функциональным классам

(табл. 100) [388-391]. Признаки дисбаланса цитокинового профиля могут отмечаться за 3-6 лет до первой манифестации заболевания [384]. Отмечено повышения провоспалительных цитокинов (IL-1α,-1β,-6, TNFα), Th1 (IL-12), Th2

(эотаксин), Th17 (IL-17), T-регуляторных (IL-10,-15) цитокинов и стромальных/ангиогенных факторов (FGF-2, GM-CSF) [384, 392]. После развития первых симптомов РА происходит повышение и уровня антивоспалительных цитокинов [384, 393]. W. Hueber и соавт. [226], проанализировавшие панель из 22

цитокинов в сыворотках 56 больных ранним РА, 21 больного ПСА/АС и 19

188

здоровых лиц, выявили при РА достоверное увеличение концентрации провоспалительных цитокинов: IL-1α, -12, -13, TNF-α и хемокинов: - IP-10, MCP- 1, эотаксина, а при ПСА и АС - только IL-8.

Нами обнаружено повышение противовоспалительных цитокинов IL-1b,-6,-15,

антивоспалительного IL-1ra, Th1 IL-2 и IFN-γ, Th2 IL-4,-5,-9,

колонистимулирующего IL-7, хемокина MIP-1α, IL-8, MCP-1 и GM-CSF. Следует отметить, что изменения концентраций цитокинов в крови при раннем РА, не обязательно напрямую связано с воспалительными процессами в синовиальной ткани, а в большей степени отражает комплексное взаимоотношение многочисленных медиаторов врожденного и приобретенного иммунитета [388].

При раннем РА обнаружен достоверно более высокий уровень Th1 (IFN-γ), Th17

цитокинов (IL-17), колониестимулирующих факторов (IL-7, G-CSF), хемокинов

(IL-8, IP-10, MIP-1α), по сравнению с развернутой стадией заболевания. Для более

Таблица 100 Изменения концентраций цитокинов в сыворотке крови и синовиальной жидкости

больных РА по данным различных авторов

190

полного понимания роли различных классов цитокинов в патогенезе раннего РА,

необходимы исследования больших когорт пациентов с ранним РА, а также

“преклинических” образцов соответствующего биоматериала [226]. Последние работы подтверждают важную роль хемокинов в патогенезе РА [394-397].

Существует предположение, что повышение не только Th1, но и в большей степени Th2 цитокинов в доклиничекий период может провоцировать появление АЦБ у больных РА. В нескольких исследованиях показана взаимосвязь гиперпродукции данных классов цитокинов с наличием АЦБ, что позволяет предположить существования субтипов РА, различающихся на молекулярном уровне [250, 384, 393]. Эти данные согласуются с результатами нашей работы,

согласно которым, у АЦБ-положительных пациентов, по сравнению с АЦБ-

негативными, достоверно повышены уровни: провоспалительных (IL-6,-12,-15, TNF-α), антивоспалительных цитокинов (IL-1ra,-13,-10), Th1 (IL-2, IFN-γ), Th2

цитокинов (IL-4,-9, эотаксина); колониестимулирующих факторов: IL-7, GM-CSF.

В зарубежной литературе также описаны корреляционные зависимости между содержанием в периферической крови IgM РФ, АМЦВ и концентрациями различных цитокинов (IL-1β -1ra,-2,-4,-6,-7,-8,-10,-12,-17, TNF-α, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, VEGF, MCP-1 и MIP-1β), что в целом совпадает с результатами настоящей работы [389, 398]. Кроме этого, нами обнаружена взаимосвязь уровней IL-1β,-1ra,- 2,-4,-6,-9,-10,-13,-15, эотаксина, GM-CSF, IFN-γ и IgA РФ при раннем РА.

В литературе, приводятся противоречивые данные о взаимосвязи между активностью РА и уровнями отдельных цитокинов [389, 390, 399, 400]. Так, Hitchon C.A. и соавт. выделили группу с “мягким” течением РА,

характеризующуюся повышенными уровнями MIP-1beta, IL-8, -2, -12, -17, -5, -10

и пониженным содержанием IL-6,-4, IFN-γ, GM-CSF и группу с “тяжелым” течением РА, где были повышены уровни IL-13, IL-12, TNF-a и IL-4. Однако,

неросредственной корреляции концентраций исследуемых биомаркеров со значениями DAS28, авторами обнаружено не было [391]. По нашим данным, при РА лишь уровень IL-6 достоверно коррелировал с значениями DAS28, и СРБ.

Однако, по данным Chung S.J. и соавт. сывороточная концентрация цитокинов