диссертации / 81

61

соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров

(n=33): 0,6 пмоль/л.

Рисунок 9

Калибровочная кривая для определения sRANCL методом ИФА.

2.2.9. Методика определения олигомерного матриксного белка хряща

Количественное определение COMP в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Human Cartilage Oligomeric Matrix Protein ELISA (“BioVendor”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения COMP

равнялась 4,0 нг/мл (рис. 10). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=33): 1400 нг/мл.

62

Рисунок 10

Калибровочная кривая для определения COMP методом ИФА.

2.2.10. Методика определения матриксной металлопротеиназы-3

Количественное определение ММП-3 в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов (“Bender MedSystems”, Aвстрия) согласно инструкции фирмы-изготовителя.

Чувствительность определения ММП-3 равнялась 0,4 нг/мл (рис. 11). В

качестве верхней границы нормы была принята концентрация,

соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров

(n=24): 9,3 нг/мл.

Рисунок 11

Калибровочная кривая для определения ММП-3 методом ИФА.

63

2.2.11. Методика очистки сыворотки крови от IgM ревматоидного

фактора

Удаление IgM РФ из исследуемых образцов сывороток крови производился с использованием набора реагентов “ВектоРФ-

иммуносорбент” ( ЗАО “Вектор Бест”, Россия) согласно инструкции фирмы изготовителя. Основным компонентом набора является аффинный сорбент, в

котором в качестве лиганда используется IgG человека, специфически связывающие IgM РФ.

2.2.12. Методика определения цитокинового профиля.

Количественное определение 27 цитокинов (IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -12, -13, -15, -17, FGF, эотаксина, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, PDGF-BB, RANTES, TNF-α, VEGF) в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом мультиплексного анализа, технологией “xMAP”, на анализаторе Bio-Plex 200 (“Bio-Rad”,

США) с использованием коммерческого набора реагентов Bio-Plex Pro Human Cytokine 27 plex assay (“Bio-Rad”, США) согласно инструкции

Таблица 13 Аналитическая чувствительность и верхняя граница нормы при определении

концентраций цитокинов методом xMAP

64

фирмы-изготовителя (рис.8). Аналитическая чувствительность определения представлена в табл. 5. В качестве верхней границы нормы была приняты концентрации, соответствующие значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=30) (табл. 13)

65

Рисунок 8 (а)

Калибровочные кривые исследуемых цитокинов, хемокинов, факторов роста

66

Рисунок 8 (б)

Калибровочные кривые исследуемых цитокинов, хемокинов, факторов роста

2.2.13. Методы оценки диагностического значения биомаркеров

при ревматоидном артрите

Оценка диагностического значения биомаркеров РА осуществлялась путем расчета операционных характеристик теста: диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС), отношения правдоподобия положительного и отрицательного результатов (ОППР и ОПОР) (табл. 14) [296].

Согласно рекомендациям ACR наиболее полезными для диагностики РА считались лабораторные тесты с ОППР>5 и ОПОР<0,2; полезными – с

ОППР>2 и ≤5, ОПОР>0,2 и ≤0,5; не имеющими пользы - с ОППР≤2 и

67

ОПОР>0,5 [43]. Для анализа диагностической эффективности лабораторных тестов использовалась также характеристическая кривая (ROC-кривая),

Таблица 14 Параметры оценки диагностической точности лабораторного теста

отражающая зависимость частоты истинно положительных результатов

(чувствительность) от частоты ложноположительных результатов (1-

специфичность). Для оценки ROC-кривых вычислялась площадь под кривой

(ППК), варьирующая от 0,5 (отсутствие диагностической эффективности теста) до 1,0 (максимальная эффективность теста) [297].

2.2.14. Методы статистической обработки результатов исследования

Статистический анализ результатов проводили при участии зав. кафедры медицинской статистики Московской Медицинской Академии им. И.М.

Сеченова, д.м.н. Герасимова А.Н., с помощью программного комплекса

EpiInfo 7.0, рекомендованного для использования в медико-биологических приложениях. Дистрибутив взят с сайта www.cdc.gov (центр слежения за заболеваемостью и смертностью, США, Атланта). Обработка результатов включала общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. Для описания распределения анализируемых показателей рассчитывали частоты встречаемости для дискретных переменных или параметры для непрерывных, используя стандартное представление M±m,

68

где M – среднее арифметическое, а m – статистическая погрешность его определения (среднеквадратичное отклонение среднего по группе) [298], а

также другие параметры, включая перцентили. Для поверки корректности использования методов параметрической статистики анализировали формы распределения переменных. В случае их не компактности (с целью исключения погрешностей при расчете достоверности различий средних по группам) использовали аналогичные методы непараметрической статистики,

т.е. проводили сравнение не исходных значений переменных, а их рангов.

При сравнении параметров с нормальным распределением применялся парный t-тест для независимых выборок. Для параметров, распределение которых отличалось от нормального, при сравнении двух групп использовали критерий Манна-Уитни, а при сравнении трех и более групп – критерий Краскела-Уоллеса, результаты представлены в виде медианы (Ме) с

интерквартильным размахом (25-й - 75-й перцентили). Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p<0,05.

Прогноз значений одной переменной по другим проводили при помощи метода многомерной линейной регрессии (многофакторного анализа), при котором прогноз показателя по показателям 1… n

n

осуществляется в виде прогноз с bk k . Коэффициенты bk в приведенных

k 1

таблицах называются нестандартизованными коэффициентами. Для сравнительного анализа вклада факторов в прогностическую модель приведены также таблицы стандартизованных коэффициентов k,

отличия от нуля. Клиническую значимость полученного прогностического правила определяли при помощи построения ROC-кривой.

69

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1.Клиническое значение аутоантител при ревматоидном артрите

3.1.1.Ревматоидные факторы

3.2.1.1. IgM ревматоидный фактор

Обследовано 993 пациента из них, 102 с ранним РА, (длительность <6 месяцев; 79 женщин и 23 мужчины; возраст: 51; 41-62 лет), 891 – с развернутым РА

(длительность >6 месяцев; 733 женщины и 158 мужчин; возраст: 51; 43-56 лет).

Статистически значимых различий по уровню IgМ РФ между группами больных ранним РА и развернутым РА не обнаружено (табл. 15).

Таблица 15 Концентрация IgМ РФ (МЕ/мл) при РА и в группе сравнения

* - р<0,05 относительно здоровых доноров, •-отностительно других РЗ,

†- р<0,05 относительно группы сравнения в целом

Концентрация IgM РФ (МЕ/мл) при раннем РА [39(5-137)] превышала таковую в группе сравнения [0,1(0,0-17), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. Увеличение сывороточной концентрации IgМ РФ (>15

70

МЕ/мл) отмечалось у 67% больных ранним РА, 54% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 13% -

низкопозитивные (табл. 16). Группа пациентов с ранним РА серопозитивных по

IgM РФ достоверно отличалась от серонегативных больных, преобладанием пациентов с высокой активностью заболевания по DAS28 (52% vs 32%; p=0,04), II-ым функциональным классом заболевания (24,5% vs 0,0, p=0,0001), с II

рентгенологической стадией по Стейнброкеру (79% vs 60%, p=0,02), более высокой концентрацией IgА РФ [54,5(23,0-200,1) vs 19,3(18,6-19,4) Ед/мл, p=0,01],

АЦЦП [100,0(9,1-100,0) vs 0,9(0,3-7,6) Ед/мл, p=0,0001] и АМЦВ [133,6(26,5- 823,0) vs 4,3(0,3-30,5) Ед/мл, p=0,0001]. В группе раннего РА с высокопозитивными значениями IgM РФ в отличие от низкопозитивных по данному показателю больных преобладали пациенты с II рентгенологической стадией заболевания (40% vs 12%, p=0,004). Среди больных ранним РА позитивных по IgM РФ, по сравнению с пациентами негативными по данному показателю чаще выявлялись IgA РФ (13/17, 76% vs 1/4, 25%, p=0,01), АМЦВ

(33/42, 79% vs 10/20, 50%, p=0,001) и АЦЦП (52/68, 76% vs 9/34, 26%, p=0,0001), c

преобладанием высокопозитивных значений АЦЦП (42/52, 90%, p=0,0001). АКА обнаруживались всего у 41% (9/22) больных ранним РА серопозитивных по IgM

РФ и у 30% (3/10) - серонегативных. При раннем РА, отмечена корреляция сывороточного уровня IgM РФ с концентрацией СРБ (p=0,03) и ЧПС (p=0,03)

(табл. 18). В целом, АЦБ обнаруживались одновременно c IgM РФ в 3,6 раза чаще

(58/68, 85%) чем изолированно (8/34, 23,5%, p=0,001). Концентрация IgM РФ

(МЕ/мл) при развернутом РА [49(9,5-200)] превышала таковую в группе сравнения [0,1(0,0-17), p=0,0001] и не зависела от пола и возраста пациентов. У

больных развернутым РА увеличение сывороточной концентрации IgМ РФ (>15

МЕ/мл) отмечалось у 66% больных РА: 52% пациентов имели высокопозитивные результаты определения данного показателя, 14% - низкопозитивные (табл. 17). У

позитивных по IgM РФ больных развернутым РА, по сранению с негативными,

выявлено более высокое содержание IgA РФ [263,3(100,7-500,0)1 vs 20,9(15,0-

29,4) Ед/мл, p=0,0001], АЦЦП [100,0(50,5-200,0) vs 13,8(0,6-100,0) Ед/мл.,