диссертации / 81
.pdf51
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Общая клиническая характеристика больных
Обследовано 993 пациента с достоверным диагнозом РА, наблюдавшихся в ФГБНУ НИИР им. В.А. Насоновой в период с 2010 по 2012 год.
Проведение исследования одобрено этическим комитетом при ФГБНУ НИИР имени В.А. Насоновой". Возраст пациентов на момент обследования варьировал от 16 до 80 лет (Ме; 25-75 перцентиль: 51; 42-57). Длительность заболевания составляла от 0,5 месяца до 44 лет (7,5; 2,5-16). Активность РА
(по DAS28) колебалась от 1 до 8 (5,2; 3,6-6,0) баллов (табл. 9). Для оценки эффективности терапии использовали критерии EULAR, основанные на динамике индекса DAS28 [288]. Изменения в суставах оценивались рентгенологически, методом Sharp в модификации van der Hejde [289, 290].
Рентгенологическая стадия заболевания определялась по методу Штейнброкера [291].
Анализ возрастного состава выявил преобладание пациентов в возрасте от
41 года и старше (73%). Соотношение женщин и мужчин в возрастных группах ≥ 41 ≤50 лет и ˃50 лет было 4,6:1 – 14:1, ≤ 20 лет – 1:0, ≥21 до≤ 30
лет: 1,7:1, ≥31 ≤ 40 лет - 2:1 (табл.10).
Диагноз РА основывался на критериях заболевания Американской коллегии ревматологов (АCR) 1987 г. и ACR/ Европейской лиги по борьбе с ревматизмом (EULAR) 2010 г. [11, 292]. Группу сравнения составили
(n=616): 27 пациентов - с системной красной волчанкой (СКВ), 15 - с
синдромом Шегрена (СШ), 25 - с анкилозирующим спондилоартритом (АС),
33 - с остеоартритом (ОА), 20 - с перекрестным (OVERLAP) синдромом, 9 - с
подагрическим артритом (ПА), 22 - с псориатическим артритом (ПCА), 168 -
с недифференцированным артритом (НА) и 297 здоровых доноров,
сопоставимых по полу и возрасту с обследованными больными (табл. 11).
52
|
|
|
|
|
Таблица 9 |
|
|
Клинико-иммунологическая характеристика больных РА |
|||||
|
|
|
|
|
|
|
Показатель |
|
Ранний РА(<6 мес.) |
Развернутый |
Группа |
|
Здоровые |
|
|
|
РА(>6 мес.) |
сравнения |
|
доноры |
n |
|
102 |
891 |
319 |
|
297 |
Пол (ж/м) |
|
79/23 |
733/158 |
240/79 |
|
222/75 |
Средний возраст (годы) |
|
51(41-62) |
51(43-56) |
44(31-53) |
|
42(32-49) |
Длительность РА (мес.) |
|
4(2,5-6) |
96(36-192) |
- |
|
- |
Рентг.стадия РА (Стейнброкер, модиф.) n(%) |
|
|
|
|
||
I |
|
29(28) |
19(2,1) |
- |
|
- |
II |
|
73(72) |
306(34,3) |
- |
|
- |
III |
|
0 |
289(32,4) |
- |
|
- |
IV |
|
0 |
277(31) |
- |
|
- |
Функциональный класс n(%)
I |
75(73,5) |
232(26) |
- |
- |
II |
27(26,5) |
578(65) |
- |
- |
III |
0 |
75(8,4) |
- |
- |
IV |
0 |
6(0,6) |
- |
- |
Системные проявления |
0 |
146(16) |
- |
- |
Активность заболевания |
|
|
|
|
DAS 28,баллы |
5,1(4,1-5,9) |
5,2(3,8-6) |
- |
- |
Ремисcия (DAS28<2,6) n(%) |
25(24,5) |
53(6) |
- |
- |
Низкая (2,6<DAS28<3,2) n(%) |
77(75,5) |
71(8) |
- |
- |
Средняя (DAS28=3,2-5,1) n(%) |
0 |
306(34) |
- |
- |
Высокая (DAS28>5,1) n(%) |
0 |
461(52) |
- |
- |
ЧПС1 |
10(8-18) |
7,5(3-14) |
- |
- |
ЧБС2 |
15(10-28,5) |
14(7-23) |
- |
- |
СОЭ,(мм/ч), Ме (25-75%) |
31(22-41) |
30(16-45) |
- |
- |
СРБ, (мг/л), Ме (25-75%) |
9,5(3,4-32,9) |
10(3,1-28,7) |
2,8(0,8-10,3) |
0,6(0,2-1,9) |
IgM РФ (n) |
102 |
891 |
319 |
297 |
IgM РФ (МЕ/мл), Ме (25-75%) |
39 (5-137) |
49 (9,5-200) |
0,0(0,0-14,3) |
0,1(0,0-0,6) |
IgM РФ+ n(%) |
68(67) |
588(66) |
77(24) |
10(3,5) |
IgM РФ высокопозит. n(%) |
54(53) |
463(52) |
43(13,5) |
4(1,5) |
IgM РФ низкопозит. n(%) |
14(14) |
125(14) |
34(10,5) |
6(2) |
IgM РФ- n(%) |
34(33) |
303(34) |
242(76) |
287(96,5) |
IgA РФ (n) |
21 |
105 |
85 |
35 |
IgA РФ (МЕ/мл), Ме (25-75%) |
27 (19-80) |
142 (25-388) |
0,1 (0,1-0,1) |
0,1 (0,1-0,1) |
IgA РФ+ n(%) |
14(67) |
87(83) |
13(15) |
0(0) |
IgA РФ высокопозит. n(%) |
6(29) |
65(62) |
8(9) |
0(0) |
IgA РФ низкопозит. n(%) |
8(38) |
22(21) |
5(6) |
0(0) |
IgA РФ- n(%) |
7(33) |
18(17) |
72(85) |
35(100) |
АЦЦП, n |
102 |
891 |
319 |
297 |
АЦЦП (Ед/мл), Ме (25-75%) |
36(0,5-100) |
100(4-100) |
0,8(0,4-1,5) |
0,1(0,1-0,6) |
АЦЦП+ n(%) |
58(57) |
649(73) |
51(16) |
6(2) |
АЦЦП высокопозит. n(%) |
53(52) |
597(67) |
42(13) |
5(1,7) |
АЦЦП низкопозит. n(%) |
5(5) |
52(6) |
9(3) |
1(0,3) |
АЦЦП- n(%) |
44(43) |
242(27) |
268(49) |
291(98) |
АМЦВ, n |
62 |
349 |
132 |
52 |
АМЦВ (Ед/мл), Ме (25-75%) |
68,5(1-692) |
273(40,7-973) |
1,2(0,3-19,3) |
0,3(0,2-11,2) |
53
Продолжение таблицы №9
Показатель |
|
Ранний РА(<6 мес.) |
|
Развернутый |
Группа |
|
Здоровые |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
РА(>6 мес.) |
сравнения |
|
доноры |
||||
АМЦВ+ n(%) |
|
|
43(69) |
|
|
|
297(85) |
|
32(24) |
|
|
3(6) |
|
||
АМЦВ высокопозит. n(%) |
|
|
31(50) |
|
|
|
245(70) |
|
7(5) |
|
|
0(0) |
|
||
АМЦВ низкопозит. n(%) |
|
|
12(19) |
|
|
|
52(15) |
|
25(19) |
|
|
3(6) |
|
||
АМЦВ- n(%) |
|
|
19(31) |
|
|
|
52(15) |
|
100(76) |
|
|
49(94) |
|||
АКА, n |
|
|
32 |
|
|
|
46 |
|
52 |
|
|
28 |
|
||
АКА+ n(%) |
|
|
12(37,5) |
|
|
|
13(41) |
|
15(29) |
|
|
7(25) |
|||
АКА- n(%) |
|
|
20(62,5) |
|
|
|
33(59) |
|
37(71) |
|
|
21(75) |
|||
1-число болезненных |
суставов, 2-число |
припухших суставов |
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Таблица 10 |
||
|
|
Распределение больных по полу и возрасту |
|
|
|
||||||||||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|||
|
|
|
|
|
Возраст (годы) |
|
|
|
|
|
|||||
|
|
≤20 |
21-30 |
31-40 |
|
|
41-50 |
|
> 50 |
|
Всего |
|
|||
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
n(%) |
|
|
|
|
|
|
|
Мужчины |
0(0) |
29(3) |
60(6) |
|
|
50(5) |
|
30(3) |
|
239(24) |
|
|||
|
Женщины |
10(1) |
50(5) |
119(12) |
|
228(23) |
|
417(42) |
|
754(76) |
|
||||
|
Всего |
10(1) |
79(8) |
179(18) |
|
278(28) |
|
447(45) |
|
993(100) |
|
||||
Таблица 11
Общая характеристика группы сравнения
Заболевание |
n |
IgM РФ “+” n(%) |
АЦЦП “+” n(%) |
СКВ |
27 |
3(11) |
0(0) |
СШ |
15 |
2(13) |
3(20) |
АС |
25 |
0(0) |
0(0) |
ОА |
33 |
4(12) |
0(0) |
OVERLAP |
20 |
13(65) |
4(20) |
ПА |
9 |
0(0) |
0(0) |
ПСА |
22 |
1(4,5) |
0(0) |
НА |
168 |
52(31) |
40(24) |
Здоровые доноры |
297 |
10 (3,5) |
6(2) |
ГИБП получали 93 пациента, из них: химерные мноклональные антитела к
TNF-α (инфликсимаб, ИНФ), 27 человек, химерные моноклональные антите-
ла к CD20 антигену В–лимфоцитов (ритуксимаб, РТМ) 34 человек, гуманизированные моноклональные антитела к рецептору IL-6 (тоцилизумаб,
54
ТЦЗ) 42 человека (табл. 12) (табл. 12) [293-295 ]. ИНФ вводили внутривенно капельно из расчета 3 мг/кг массы тела, первые 2 инфузии с интервалом в 2
недели, следующие инфузии через 6 недель и далее каждые 8 недель. РТМ вводился по 1000 мг внутривенно, двукратно с интервалом в 2 недели.
Инфузии ТЦЗ проводились в дозе 8 мг/кг внутривенно с интервалом в 4
недели. Клинические и лабораторные показатели анализировались непосредственно перед началом терапии (нулевая точка) и через 24 и 40
недель после инфузии. Терапевтический эффект при применении ГИБП оценивался согласно критериям EULAR [288].
Таблица 12
Общая характеристика пациентов получавших терапию ГИБП
ГИБП |
ИНФ (n=27) |
РТМ (n=34) |
ТЦЗ (n=42) |
Женщины/мужчины |
25/2 |
31/3 |
32/10 |
Средний возраст, годы |
46,5; 41,5-61,5 |
49; 42-64 |
51; 43-55 |
|
|
|
|
Длительность РА (мес.) |
60; 36-192 |
72; 36-132 |
56; 23-81 |
DAS28 |
6; 5-6 |
6; 5,5-6 |
6,5; 6-7 |
СОЭ мм/ч |
56; 36-76 |
56; 37-62 |
54; 34-74 |
СРБ мг/л |
24; 12-59 |
20; 14-46 |
34; 20-75 |
Позитивность по IgM РФ n(%) |
17 (62) |
30(97) |
38(88) |
Позитивность по АЦЦП n(%) |
23(86) |
30(97) |
40(93) |
2.2. Методы исследования
Всем больным проводилось полное клиническое, лабораторное и инструментальное обследование с использованием стандартных методов,
применяемых в ФГБНУ НИИР им В.А. Насоновой.
Рентгенографические исследования выполнялась в лаборатории лучевой диагностики (заведующий лабораторией - д.м.н., А. В. Смирнов).
Исследование клинических, биохимических показателей крови осуществляли
55
унифицированным методом в биохимической лаборатории (заведующая лабораторией – к.б.н. Л. Н. Кашникова). Иммунологическое исследование крови проводили в лаборатории иммунологии и молекулярной биологии ревматических заболеваний (заведующая лабораторией - д.м.н. Е.Н.
Александрова).
Для решения поставленных задач проводился комплекс иммунологических исследований, который включал определение в сыворотке крови уровня IgM и IgA ревматоидных факторов, АЦЦП, АМЦВ,
АКА, СРБ, кальпротектина, 27 цитокинов, хемокинов и факторов роста, sRANKL, COMP и MMП-3.
Кровь из локтевой вены в количестве 9 мл. собирали в вакуумную пробирку S-Monovette («Sarstedt», Германия) с активатором свертывания крови. Пробирку с кровью оставляли на 30 минут при комнатной температуре в вертикальном положении для образования сгустка, затем центрифугировали 15 минут при 1100 – 1300 g с охлаждением до 40С. После центрифугирования СК собирали, перемешивали и аликвотировали по 0,3 мл в микропробирки типа “эппендорф”. Забор СЖ проводился путем введения стерильной пункционной иглы в полость коленного сустава. Полученные образцы аликвотировали по 0,3 мл в пробирки типа “эппендорф”. Все образцы исследуемого биологического материала хранили при -700С.
Интервал между процедурой взятия крови и замораживанием образцов сывороток составлял не более 30 минут.
2.2.1. Методика определения IgM ревматоидного фактора
Концентрацию IgM РФ в сыворотке крои и синовиальной жидкости измеряли иммунонефелометрическим методом с латексным усилением на анализаторе BN-ProSpec (“Siemens”, ФРГ) при использовании реагентов N Latex RF Kit (“Siemens”, ФРГ).
56
Чувствительность определения IgМ РФ равнялась 9,5 Ме/мл (рис. 1). Верхняя граница нормы составляла 15 МЕ/мл, согласно рекомендации производителя.
Рисунок 1
Калибровочная кривая для определения IgM РФ методом иммунонефелометрии.
2.2.2. Методика определения IgA ревматоидного фактора
Количественное определение IgA РФ в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов
Rheumatoid Factor IgA (“ORGENTEC Diagnostika”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения IgA РФ равнялась 0,1 ЕД/мл (рис. 2). Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл,
согласно рекомендации производителя.
57
Рисунок 2
Калибровочная кривая для определения IgA РФ методом ИФА.
2.2.3. Методика определения антител к циклическому
цитруллинипрванному пептиду
Количественное определение АЦЦП в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-CCP (“Axis-Shield”, Великобритания) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения АЦЦП равнялась 0,1 ЕД/мл (рис.3). Верхняя граница нормы составляла 5 ЕД/мл,
согласно рекомендации производителя.
Рисунок 3
Калибровочная кривая для определения АЦЦП методом ИФА.
58
2.2.4. Методика определения к циклическому модифицированному
виментину
Количественное определение АМЦВ в сыворотке крови и синовиальной жидкости проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов Anti-MCV (“ORGENTEC Diagnostika”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения AМЦВ равнялась 0,1 ЕД/мл (рис. 4). Верхняя граница нормы составляла 20 ЕД/мл,
согласно рекомендации производителя.
Рисунок 4
Калибровочная кривая для определения АМЦВ методом ИФА.
2.2.5. Методика определения антител к кератину
Качественное определение АКА в сыворотке крови проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции (НРИФ) с использованием коммерческого набора реагентов Immuno Glo, Anti-Keratin Antibody IFA
(“IMMCO Diagnostics”, США) согласно инструкции фирмы-изготовителя.
Результаты считались положительными при наличии свечения АКА в титре
1:10, согласно рекомендации производителя (рис. 5).
59
Рисунок 5
АКА при определении методом НРИФ
2.2.6. Методика определения С-реактивного белка
Концентрацию вч-СРБ в сыворотке крови и синовиальной жидкости измеряли высокочувствительным иммунонефелометрическим методом с латексным усилением анализаторе BN-ProSpec (“Siemens”, ФРГ) при использовании реагентов CardioPhase hsCRP (“Siemens”, ФРГ).
Чувствительность метода - 0,175 мг/л (рис. 6). Верхняя граница нормы составляла 5,0 Мг/л, согласно рекомендации производителя.
Рисунок 6
Калибровочная кривая для определения вч-СРБ методом иммунонефелометрии.
60
2.2.7. Методика определения кальпротектина
Количественное определение КП в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов
Calprotectin ELISA (“Buhlmann Laboratories”, ФРГ) согласно инструкции фирмы-изготовителя. Чувствительность определения кальпротектина <0,4
мкг/мл (рис.7). В качестве верхней границы нормы была принята концентрация, соответствующая значению 95 перцентиля данного показателя у доноров (n=33): 20 мкг/мл.
Рисунок 7
Калибровочная кривая для определения кальпротектина методом ИФА.
2.2.8. Методика определения лиганда рецептора активатора
транскрипционного фактора κB
Количественное определение sRANCL в сыворотке крови проводилось методом ИФА с использованием коммерческого набора реагентов sRANKL
(“Biomedica”, Aвстрия) согласно инструкции фирмы-изготовителя.
Чувствительность определения sRANKL равнялась 0,08 пмоль/л (рис. 9). В
качестве верхней границы нормы была принята концентрация,