Микробный роман ч

V. Сборка вирусных частиц – происходит самопроизвольно благодаря «узнаванию» белками и нуклеиновыми кислотами друг друга путем нековалентных взаимодействий (гидрофобных, водородных, ионных), местами окончательной сборки являются мембраны ЭПС и комплекса Гольджи; полностью созревают на этом этапе только простые вирусы.

VI. Выход вирионов из клетки – происходит у простых вирусов путем накопления большого их числа и «взрыва» клеточной мембраны с гибелью клетки, а у сложных – путем почкования, в процессе которого вирус приобретает суперкапсид (за счет участка клеточной мембраны), а также М-белок и гликопротеиновые шипы/нити, которые «ожидают» нуклеокапсид сложного вируса у мембраны; клетка при этом обычно не гибнет.

133.3. Стратегии репродукции ДНК-вирусов

К ДНК-геномным вирусам относятся вирусы групп I, II и VII по Балтимору.

I: ДНК, двунитевая (герпесвирусы, аденовирусы, поксвирусы):

•вирусная ДНК проникает в ядро клетки, где транскрибируется клеточной ДНКзв РНКпм;

•рибосомы, используя образованные мРНК, синтезируют вирусные белки;

•репликация ДНК производится вирусной ДНКзв ДНКпм.

II: ДНК, однонитевая (парвовирусы):

• вирус использует клеточную ДНКзв ДНКпм для создания двунитевого вирусного генома;

• в остальном процесс аналогичен описанному выше.

VII: ДНК, двунитевая, имеется РНК-стадия (вирус гепатита В):

• уникальный цикл репродукции вируса гепатита В подробно описан в 143.1.

133.4. Стратегии репродукции РНК-вирусов

К РНК-геномным вирусам относятся вирусы групп III, IV, V и VI по Балтимору.

IV: РНК, однонитевая, положительная (пи-

корнавирусы и др.):

• вирусная РНК непосредственно распознается рибосомами, транслируется в единый полипептид, который нарезается кле-

точными протеазами на вирусные белки, включая вирусную РНК-полимеразу;

•вирусная РНКзв РНКпм образует на матрице +РНК множество цепей –РНК, на матрице которых, в свою очередь, строит либо +РНК для новых популяций вирусных частиц, либо мРНК для ускоренного синтеза вирусных белков;

•все эти процессы происходят в цитоплазме.

V: РНК, однонитевая, негативная (ортомиксовирусы и др.):

• эти вирусы имеют вирусную РНКзв РНКпм в составе вириона, так как их геном непосредственно не может служить матрицей для рибосом;

•вирусная РНКзв РНКпм образует на матрице –РНК неполные нити (мРНК для синтеза отдельных белков) и полные нити (+РНК-матрица для синтеза геномной –РНК для новых популяций);

•все процессы также происходят в цитоплазме.

III: РНК, двунитевая (ротавирусы и др.):

•механизм схож с репликацией вирусов V группы;

•полные нити +РНК используются еще и для создания геномной двунитевой РНК.

11

VI: РНК, однонитевая, имеется ДНК-стадия (ретровирусы):

•эти вирусы в вирионе имеют особый фермент – обратную транскриптазу, или РНКзв ДНКпм;

•обратная транскриптаза на матрице геномной +РНК строит –ДНК, которая затем достраивается до двунитевой кольцевой ДНК;

•двунитевая ДНК служит матрицей для синтеза и мРНК, и геномной РНК вируса (в обоих случаях работает ДНКзв РНКпм);

•подробно цикл репродукции ретровирусов (на примере ВИЧ) описан в 145.2.

133.5. Стратегии репродукции вирусов: обобщение

Обобщая изложенное выше, можно кратко сформулировать следующие общие закономерности:

1)ДНК-вирусы (кр. вируса гепатита В) реплицируют геном при помощи ДНК-полиме- разы, а при помощи РНК-полимеразы образуют матрицы для синтеза белков.

2)РНК-положительные вирусы непосредственно транслируются на рибосомах, затем образовавшаяся РНК-зависимая РНК-полимераза создает –РНК копию, а уже на ней +РНК копии для синтеза белков или для нового генома.

3)РНК-негативные вирусы сперва должны при помощи имеющейся у них РНК-за- висимой РНК-полимеразы создать +РНК копию, а уже эти копии транслируются на рибосомах или включаются в новый геном.

4)Ретровирусы представляют особый случай: у них имеется РНК-зависимая ДНКполимераза (обратная транскриптаза), которая синтезирует на матрице вирусной РНК однонитевую ДНК, которая затем достраивается до двунитевой и служит матрицей для синтеза и геномной РНК, и мРНК.

12

134. Локальные и системные механизмы противовирусного иммунитета. Факторы врождённого и приобретённого противовирусного иммунитета. Интерфероны: классы, свойства, механизмы противовирусной активности

134.1. Противовирусный иммунитет

Вирусы как антигены чаще всего являются хорошими стимуляторами клеточных и гуморальных реакций. Антигенный состав вирусов включает:

-собственные антигены вируса, наиболее значимыми (протективными) среди которых обычно являются поверхностные антигены, ответственные за прикрепление к клеткам;

-антигены клетки-хозяина, которые вирусы встраивают в свои оболочки в ходе репродукции;

-вирусиндуцированные антигены, которые не содержатся в обычном случае ни в вирионе, ни в клетке-хозяине, но образуются в ней в процессе репродукции вируса.

Кфакторам врожденного противовирусного иммунитета относятся:

• физические барьеры – кожные покровы и слизистые оболочки;

• интерфероны – подробнее см. далее;

• NK-клетки (натуральные киллеры) – уничтожают инфицированные клетки, не требуя активации Т-хелперами, а также выделяют гамма-интерферон;

• макрофаги – фагоцитоз, особенно после начала выработки антител, и презентация антигенов вируса Т-хелперам;

• система комплемента (меньшая роль) – ↑ нейтрализующей способности антител;

• физиологические реакции (повышение температуры, воспаление, выделение).

Кфакторам приобретенного противовирусного иммунитета относятся:

•антитела, вырабатываемые В-лимфоцитами:

-после процессинга антигенов антигенпрезентирующими клетками они представляются Т-хелперам, активирующим при помощи сигнальных молекул В-лимфоциты, которые превращаются в плазмоциты и синтезируют антитела;

-антитела служат главным препятствием для распространения вируса по организму;

-как правило, не оказывают действие на вирус, находящийся внутри клетки, хотя иногда при помощи комплемента могут лизировать зараженную клетку;

-зачастую достигают защитного титра уже после выздоровления, но эффективно защищают от повторной инфекции;

•Т-киллеры (цитотоксические, CD8+-лимфоциты):

-основной механизм противовирусной защиты;

-активируются Т-хелперами и распознают чужеродные антигены на зараженных клетках;

-уничтожают зараженные клетки;

-постинфекционный Т-клеточный иммунитет формируется не всегда.

134.2. Интерфероны

Интерфероны (ИФ) – группа белков гликопротеиновой природы, которые синтезируются клетками человека и животных под влиянием различных индукторов (вирусов, бактерий, простейших и др.) и обладают противовирусной и иммуномодулирующей активностью.

Известно три класса ИФ:

•ИФ-α (лейкоцитарный) и ИФ-β (фибробластный):

-синтезируются инфицированными клетками;

-непосредственно на вирус не действуют;

-подавляют внутриклеточную репликацию вирусов путем ингибирования синтеза белка и активации эндонуклеазы, разрушающей молекулы РНК (в т.ч. вирусов);

13

-обладают небольшой иммуномодулирующей активностью;

•ИФ-γ (иммунный):

-синтезируются Т-лимфоцитами, NK-клетками, активированными макрофагами;

-обладают высокой иммуномодулирующей активностью;

-сильно активируют NK-клетки и макрофаги, усиливают активность В-лимфоцитов;

-в меньшей степени подавляют внутриклеточную репликацию.

Интерфероны всех классов также обладают противоопухолевой активностью, замедляя клеточную пролиферацию и вызывая апоптоз опухолевых клеток.

14

135. Принципы этиологической диагностики вирусных инфекций. Экспрессметоды. Серологический метод диагностики: принципы проведения, критерии постановки диагноза. Реакция торможения гемагглютинации (гемадсорбции). Реакция нейтрализации

135.1. Методы диагностики вирусных инфекций. Экспресс-методы

При диагностике вирусных инфекций используются следующие методы: вирусологи-

ческий, серологический, молекулярно-генетический, реже микроскопический и биологи-

ческий. Лабораторные методы при диагностике вирусных инфекций направлены на:

-выделение и идентификацию возбудителя («золотой стандарт»);

-обнаружение антигенов в исследуемом материале;

-обнаружение и определение титров противовирусных антител;

-микроскопическое исследование препаратов исследуемого материала.

Под экспресс-методами понимают группу методов, позволяющих быстро и надежно (с высокой чувствительностью и специфичностью) обнаружить вирус или его антигены в исследуемом материале. По классификации большинство таких методов относятся к серологическим. При диагностике вирусных инфекций применяют:

•реакция иммунофлюоресценции (РИФ);

•иммунная электронная микроскопия (обработка препарата специфической проти-

вовирусной сывороткой и электрон-контрастным веществом, после чего при положи-

тельном результате при электронной микроскопии видны скопления вирусных частиц);

•встречный иммуноэлектрофорез (образование линий преципитации в агаре между лунками с антителами и антигенами при проведении электрофореза);

•реакция гемадсорбции на твердой основе;

•ИФА с индикаторными полосками (лунками) для поиска антигенов;

•иммуноблоттинг (ВИЧ);

•ПЦР и гибридизация ДНК in situ (молекулярно-генетические методы).

135.2. Серологический метод диагностики

Серологические методы при диагностике вирусных инфекций применяются широко. Важно знать, что при исследовании антител почти во всех случаях исследуют парные сыворотки: первый образец забирают немедленно, а второй – через 10-14 дней. Диагностическим считается нарастание титра антител не менее, чем в четыре раза. Исследование именно парных сывороток позволяет убедиться, что обнаруженные антитела не имеют отношение к перенесенной в прошлом инфекции, а именно к этому случаю.

В связи с этим определение антител зачастую имеет ретроспективный характер, поскольку через две недели, которые занимает проведение исследования, его клиническое значение обычно минимальное (зачастую инфекция к этому времени уже разрешается). Однако при исследовании некоторых антител (ВИЧ, вирусы гепатитов) парные сыворотки применять необязательно.

К серологическим методам диагностики вирусных инфекций относятся следующие методы:

1) методы идентификации вируса:

• реакция нейтрализации (РН) – неизвест-

ный вирус смешивают с известными антисыворотками (по отдельности) и вносят в монослой клеток; при отрицательном результате (несовпадение сыворотки и вируса) клетки поражаются (А) и гибнут; при положительном результате (Б), то есть когда сыворотка подобрана верно, гибели клеток не наблюдается;

15

•реакцию интерференции используют для вирусов, которые не оказывают видимого ЦПД (не убивают и не изменяют пораженные клетки); сперва ее проводят так же, как РН,

ав конце к новой культуре добавляют еще и известный вирус с выраженным ЦПД; если ЦПД не проявилось, это означает, что известный вирус не смог поразить клетки, так как они уже были поражены исследуемым (неизвестным вирусом), то есть наблюдается явление интерференции; если же ЦПД в монослое проявилось, это означает, что известный вирус свободно поразил клетки, а исследуемый вирус был успешно нейтрализован антисывороткой, то есть примененная антисыворотка соответствует исследуемому вирусу;

•прямая РИФ;

•иммунная электронная микроскопия;

•реакция торможения гемагглютинации (РТГА) применяется для вирусов, обла-

дающих гемагглютинирующей активностью (гриппа, кори, краснухи и др.); культуру возбудителя смешивают с известной антисывороткой и эритроцитами; наличие гемагглютинации говорит о несоответствии сыворотки и возбудителя, а отсутствие (то есть торможение) гемагглютинации – о соответствии; в варианте реакции с торможением гемадсорбции (РТГАдс) эритроциты вносят в клеточную культуру и при несоответствии сыворотки наблюдают под малым увеличением микроскопа прилипание (адсорбцию)

эритроцитов на клетках;

2) выявление антигенов:

•ИФА;

•РОНГА (редко);

3) выявление антител в крови:

(см. описание отдельных методов в части второй пособия – «Иммунология»)

•ИФА;

•РТГА;

•реакция связывания комплемента (РСК);

•непрямая РИФ;

•радиоиммунный анализ (РИА).

16

136. Культивирование вирусов. Культуры клеток: виды, методы заражения. Индикация и идентификация вирусов в культуре клеток. Типы ЦПД. Вирусные включения: природа, локализация, диагностическое значение

136.1. Культивирование вирусов. Клеточные культуры

Вирусы могут культивироваться в культурах клеток, куриных эмбрионах и лабораторных животных. Эти методы являются длительными, трудоемкими и затратными, но в то же время считаются «золотым стандартом» диагностики.

Культуры клеток, используемые для культивирования вирусов, разделяют на:

1)первичные:

-получают из ткани путем механического измельчения и обработки протеолитическими ферментами;

-наиболее распространены культуры клеток почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека;

-срок жизни органичен (2-3 недели);

2)полуперевиваемые:

-срок жизни увеличен, способы выдерживать 50-100 пассажей;

-наиболее распространены культуры фибробластов эмбриона человека;

3)перевиваемые:

-обладают потенциальным бессмертием;

-большинство происходят из опухолевых клеток;

-наиболее распространены культуры HeLa (карцинома шейки матки), Hep-2 (карцинома гортани), RH (почка человека).

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. Ростовые среды обеспечивают активное размножение клеток для формирования монослоя, а поддерживающие – переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят взвесь материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов.

После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

136.2. Индикация и идентификация вирусов в культуре. ЦПД. Вирусные включения

Индикация вирусов – это процесс установления наличия их в культуре без уточнения видовой принадлежности. Для индикации используются следующие методы:

•определение цитопатического действия (ЦПД), то есть характерного нарушения морфологии клеток, обнаруживаемого при микроскопии культур:

-гигантские многоядерные клетки – симпласты (парамиксовирусы);

-скопления набухших круглых клеток (аденовирусы);

-крупнозернистая дегенерация (герпесвирусы);

-дегенерация клеток с вакуолизацией (ретровирусы, флавивирусы);

-отсутствие ЦПД (также может быть диагностическим признаком);

•определение бляшкообразования:

-бляшки – это участки монослоя, на которых клетки разрушены вирусом;

-выглядят как зоны просветления;

-могут подсчитываться для определения цитопатогенности вируса в бляшкообра-

зующих единицах (БОЕ).

•положительная реакция гемадсорбции;

17

•положительная реакция интерференции (при отсутствии ЦПД);

•цветная реакция:

-в среду вносят индикатор pH, который при нормальной жизнедеятельности клеток изменяет окраску из-за накопления в среде различных метаболитов;

-при заражении вирусом клеточный метаболизм резко снижается и окраска индикатора не изменяется;

•образование в клетках вирусных включений:

-представляют собой вирусные «фабрики» или скопления вирусных частиц;

-цитоплазматические: тельца Негри (бешенство), тельца Гварниера и Пашена (натуральная оспа);

-внутриядерные: тельца Каудри (простой герпес и ветряная оспа), Липшютца (ветряная оспа), «совиные глаза» (цитомегаловирусная инфекция).

Идентификация вирусов – это процесс надежного установления их видовой принадлежности. Она проводится при помощи серологических методов (РТГА, РТГАдс, РН,

РСК, РНГА, ИФА, РИФ, РИА) и молекулярно-генетических методов (ПЦР, молекуляр-

ная гибридизация).

18

137. Культивирование вирусов в курином эмбрионе: методы заражения, индикации и идентификации вирусов. Культивирование вирусов на лабораторных животных: методы заражения, индикации и идентификации вирусов

137.1. Культивирование вирусов в курином эмбрионе

Куриные эмбрионы для некоторых вирусов (гриппа, кори, герпеса) являются идеальными моделями для культивирования. Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне или развитию спонтанных инфекций.

Заражение производят одним из четырех методов:

•на хорион-аллантоисную мембрану (вирусы натуральной оспы, герпеса);

•в амниотическую полость (вирусы кори, паротита, гриппа);

•в аллантоисную полость (вирусы гриппа);

•в желточный мешок (вирус бешенства).

Индикацию вируса проводят при помощи РГА, исследования специфических поражений хорион-аллантоисной мембраны (особенно у герпесвирусов), также на наличие вируса указывает гибель эмбрионов.

Идентификацию проводят при помощи РТГА (для вирусов с гемагглютинирующей активностью, например гриппа), РН, РИФ и РСК.

137.2. Культивирование вирусов на лабораторных животных

Лабораторных животных можно использовать для культивирования вирусов с учетом их естественной восприимчивости и тропизма вируса. Наиболее часто заражают мышей, кроликов, обезьян и новорожденных мышат (мышат-сосунков).

Наиболее часто этот метод используют для культивирования вирусов гриппа, Коксаки, гепатита В, герпеса, бешенства, некоторых арбовирусов и аренавирусов. Многие вирусы ввиду невосприимчивости животных культивировать этим способом невозможно. В настоящее время применение метода вследствие дороговизны, сложности и гуманных соображений в основном ограничено исследовательскими (а не диагностическими) целями.

В зависимости от того, к каким тканям у вируса имеется тропизм, заражение производят следующими способами:

-подкожно (оспа) и внутримышечно;

-интраназально (грипп);

-интраперитонеально;

-интрацеребрально (бешенство) и др. способами.

Для индикации вируса оценивают состояние животного, клиническую картину развившейся болезни, патоморфологические изменения тканей органов. Для идентификации используют экскреты или секционный материал животного, проводится она теми же методами, что и при заражении куриного эмбриона.

19