Иммуноферментный анализ (ИФА) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы Учебно-методическое пособие

УДК 616.9 ББК 55.1

И53

И53 Иммуноферментный анализ (ИФА) в клинической лабораторной диагностике. Общие принципы. Учебно-методическое пособие. / К.В. Шалепо, Е.В. Спасибова, О.В. Будиловская, Т.А. Хуснутдинова, А.А. Крысанова, Е.В. Шипицына, С.В. Воробьев, А.М. Савичева. – СПб.: СПбГПМУ, 2018. – 24 с.

ISBN 978-5-907065-00-0

Вучебно-методическом пособии представлены основы твердофазного ИФА

вклинической лабораторной диагностике. Подробно описан принцип анализа в различных его вариантах для обнаружения антигенов, качественного и количественного определения антител различных классов в сыворотке крови, плазме, ликворе и др. Учебно-методическое пособие предназначено для специалистов клинической лабораторной диагностики, бактериологов, акушеровгинекологов, урологов, дерматовенерологов, инфекционистов, врачей общей практики, лаборантов, медицинских техников и др. Учебно-методическое пособие может быть использовано в качестве учебного материала при подготовке врачей при различных формах последипломного обучения.

Рецензенты:

Эмануэль Владимир Леонидович – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, директор научно-методического центра МЗ РФ по молекулярной медицине на базе СПбГМУ им. И. П. Павлова

Королюк Александр Михайлович – д.м.н., профессор, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии лабораторной диагностики ФГБОУ ВО СПБГПМУ Минздрава России

УДК 616.9 ББК 55.1

Утверждено учебно-методическим советом Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации

2

Основы иммуноферментного анализа

Иммуноферментный анализ (ИФА) – лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных низкомолекулярных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакция антигенов (АГ) с антителами (АТ). Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для визуализации реакции.

ИФА появился в середине 60-х годов и первоначально был разработан как метод для идентификации антигена в гистологическом препарате, а также для визуализации линий преципитации в тесте иммунодиффузии и иммуноэлектрофореза, а затем стал использоваться для количественного определения антигенов и антител в биологических жидкостях. В разработке метода принимали участия Е. Энгвалл и Р. Пэлман, а также независимо от них В. Ван Вееман и Р. Шурс. ИФА используется для выявления антител или антигенов в биологических жидкостях. Общая схема ИФА представлена на рис.1.

Рис. 1. Схема ИФА. А – определение антигена (на твердую фазу нанесены антитела), Б – определение антител (на твердую фазу нанесен антиген)

4

ИФА состоит из 3 обязательных стадий:

1.Стадия связывания АГ и АТ и образование иммунного комплекса.

2.Стадия формирования связи конъюгата с иммунным комплексом.

3.Стадия визуализации: превращения ферментной метки в регистрируемый сигнал.

Преимущества ИФА:

Высокая чувствительность, позволяющая выявлять концентрации до 0,05 нг/мл Чувствительность метода определяется способностью одной молекулы фермента катализировать превращение большого количества молекул субстрата

Возможность использовать минимальные объемы исследуемого материала

Стабильность при хранении всех ингредиентов (до года и более)

Простота проведения реакции

Наличие инструментального (как в качественном, так и количественном вариантах) и визуального учета

Возможность автоматизации всех этапов реакции

Относительно низкая стоимость

За счёт несомненных преимуществ иммуноферментного анализа: удобства в работе, быстроты, объективности за счёт автоматизации учёта результатов, возможности исследования иммуноглобулинов различных классов (что важно для ранней диагностики заболеваний и их прогноза) ИФА в настоящее время является одним из основных методов лабораторной диагностики.

В основе иммунологических реакций лежат следующие принципы:

1.Комплементарность («ключ к замку») – взаимодействие АГ и АТ строго специфично: происходит связывание антигенной детерминанты с активным центром Fab–фрагмента АТ (за счет ванн-дер-ваальсовых сил, водородных и гидрофобных взаимодействий). Прочность связи определяется степенью пространственного соответствия активного центра АТ и эпитопа АГ.

2.Эквивалентность – иммунологическая реакция проходит при эквивалентных (соответствующих друг другу) соотношениях количества АГ и АТ

(рис. 2).

Рис. 2. Принцип эквивалентности в иммунологических реакциях. Слева направо: избыток АТ, оптимальная пропорция АГ и АТ, избыток АГ

5

3. Иммунологическая реакция имеет двухфазный характер: а) специфическое взаимодействие – фаза «невидимая»;

б) неспецифическая фаза – проявляется визуально (например, образованием хлопьев при агглютинации и др.) (рис. 3).

Рис. 3. Две фазы иммунологической реакции – специфическая («невидимая») и неспецифическая (визуально проявляющаяся)

Взаимодействие антигена с субпопуляцией антител

Ранее для количественного описания эффективности взаимодействия АГ:АТ за основу была взята простая модель взаимодействия одновалентного АГ и одновалентного АТ. Но так как молекула АТ имеет несколько антигенсвязывающих центров и, кроме того, способна взаимодействовать с несколькими антигенными детерминантами одной молекулы АГ, то такая характеристика образования иммунохимического комплекса является весьма упрощённой. Для описания более близкого к реальности процесса взаимодействия поливалентного АТ с поливалентным АГ введён термин авидность, или функциональная аффинность (функциональное сродство). С биологической точки зрения именно функциональная аффинность играет основную роль в иммунном ответе на инфицирование организма вирусами или бактериями, имеющими на своей поверхности повторяющиеся антигенные детерминанты.

Процесс образования комплекса АГ:АТ состава 1:1, в котором реализуются поливалентные взаимодействия, также является обратимым и может быть охарактеризован константой устойчивости комплексообразования. С энергетической точки зрения образование поливалентного комплекса намного выгоднее, чем моновалентного. Например, эффективная константа устойчивости комплексообразования IgG может в 1000 и более раз превышать константу одиночных связей.

Варианты проведения ИФА

В настоящее время разработано большое число различных вариантов проведения ИФА, имеющих как принципиальные, так и второстепенные отличия. Единая чёткая классификация всего многообразия методов ИФА в литературе

6

отсутствует, что затрудняет выявление общих закономерностей и проведение сравнительной оценки возможностей различных методов. Обычно рассмотрение методов ИФА осуществляется с позиций разделения на гетерогенные и гомогенные, то есть по принципу проведения всех стадий анализа с участием твёрдой фазы или же только в растворе.

Первичным процессом в ИФА является стадия «узнавания» анализируемого соединения АГ специфическими АТ. Так как процесс образования иммунохимических комплексов происходит в строго количественном соотношении, обусловленном аффинностью, концентрациями компонентов и условиями реакции, то достаточным для определения исходной концентрации анализируемого соединения является количественная оценка образовавшихся иммунных комплексов. В случае анализа АГ для проведения такой оценки существует два подхода:

1.Прямое измерение концентрации образовавшихся комплексов;

2.Определение концентрации оставшихся свободными (не вступивших в реакцию) АТ.

Очевидно, что в последнем случае число образовавшихся иммунных комплексов определяется по разности общего числа добавленных антител и числа антител, оставшихся свободными.

По принципу проведения всех стадий анализа с участием твёрдой фазы или в растворе различают следующие варианты ИФА:

Гомогенный – если все 3 стадии ИФА проходят в растворе и нет этапов разделения образовавшихся иммунных комплексов.

Гетерогенный – при котором АГ или АТ фиксируются на твердой фазе (полистироловые планшеты или шарики).

Гомо-гетерогенные – если I стадия - образование иммунных комплексов - проходит в растворе, а затем для разделения компонентов используют твердую фазу.

Наиболее широко в клинической практике используется гетерогенный, или твердофазный, вариант проведения ИФА. По типу иммунохимического взаимодействия на первой стадии анализа (в которой происходит связывание АГ и АТ) различают неконкурентный и конкурентный ИФА.

Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела), то ме-

тод является неконкурентным.

Если же на первой стадии в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог (меченное ферментом анализируемое соединение или анализируемое соединение, иммобилизованное на твердой фазе), конкурирующие за ограниченное количество центров специфического связывания, то метод является конкурентным. В случае конкурентного ИФА определяемые антигены или антитела конкурируют с аналогичными меченными антигенами или антителами конъюгата за места связывания с иммуносорбентом. Анализ этого типа часто используют для определения антигенов, присутствующих в высоких концентрациях или гормонов, имеющих только один антигенсвязывающий центр.

7

Среди неконкурентных схем твердофазного ИФА существует три основных формата: прямой, непрямой и «сэндвич». Различия между этими вариантами заключаются в следующем.

В непрямом варианте ИФА на первой стадии на поверхность лунок полистирольного планшета сорбируется антиген. После удаления несвязавшихся молекул антигена добавляется образец, содержащий специфичные к данному антигену антитела. Образовавшиеся комплексы антиген-антитело детектируются с помощью анти-видовых антител, конъюгированных с какой-либо меткой (рис. 4А). Меченные антивидовые АТ позволяют выявлять АТ к разным антигенам.

Рис. 4. Принцип непрямого (А), прямого (Б) и иммуноанализа «сэндвич-типа» (В)

В прямом варианте детекция сорбированного антигена осуществляется непосредственно с помощью специфичных антител, конъюгированных с меткой. Поскольку добавленная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов (рис. 4Б). Преимущество – небольшое число стадий. В иммуноанализе «сэндвич-типа» на первой стадии на поверхность планшета сорбируется не антиген, а антитела, специфичные к исследуемому антигену (антитела подложки). После удаления не связавшихся молекул антител добавляется образец, содержащий антиген. Для детекции образовавшегося комплекса антитела подложки-антиген добавляются вторые антитела, специфичные к другому, пространственно удаленному, эпитопу антигена, конъюгированные с какой-либо меткой. На стадии выявления специфического иммунокомплекса антиген оказывается как бы зажатым между молекулами иммобилизованных и меченных антител, что послужило поводом для широкого распространения названия «сэндвич»-метод. По аналогичной схеме работают тест-системы для определения антител, но в качестве иммуносорбента в них используется антиген, а конъюгат содержит раствор антигена, меченного ферментом (рис. 4В). Использование в иммуноанализе «сэндвич-типа» антител, специфичных к двум различным эпитопам антигена, позволяет добиться высокой чувствительности и специфичности при определении антигена даже в таких гетерогенных образцах, как плазма крови.

8

Среди конкурентных схем твердофазного ИФА существует два основных формата: прямой и непрямой.

При прямом конкурентном формате ИФА используются иммобилизованные на твердой фазе специфические антигены, а меченные ферментом и немеченые антитела конкурируют за связь с иммобилизованным антигеном. После инкубирования образуются иммунные комплексы двух видов: содержащие ферментную метку (меченые) и без неё (немеченые). Чем больше определяемых (немеченых) антител содержит исследуемый образец, тем больше конкуренция с мечеными антителами и, следовательно, образуется меньше меченых иммунокомплексов. Далее, после отмывки носителя от несвязавшихся компонентов, добавляют субстрато-хромогенный реагент и регистрируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов (рис. 5). Таким образом, величина детектируемого сигнала, получаемого прямым конкурентным ИФА, находится в обратной зависимости от концентрации антигена.

Преимуществом прямой схемы является небольшое число стадий, что позволяет легко автоматизировать анализ. К недостаткам схемы относятся сложность методов синтеза ферментных конъюгатов, а также возможное влияние компонентов образца на активность фермента.

Рис. 5. Схема прямого конкурентного ИФА

В непрямом конкурентном формате ИФА используются меченные ферментом антивидовые антитела (специфические или вторичные) и иммобилизованный на твердой фазе конъюгат антиген-белок-носитель. На поверхности носителя иммобилизуют конъюгат антиген-белок, к которому добавляют раствор, содержащий определяемый антиген и фиксированную концентрацию немеченых специфических антител, инкубируют. После удаления не связавшихся компонентов добавляют фиксированную концентрацию меченых вторичных антивидовых антител. После инкубации и отмывки носителя детектируют ферментативную активность образовавшихся на твердой фазе специфических иммунных комплексов.

Величина детектируемого сигнала также, как и при использовании прямого конкурентного метода, находится в обратно-пропорциональной зависимости от концентрации определяемого антигена.

Применение универсального реагента — меченых антивидовых антител — даёт возможность выявлять антитела к разным антигенам. Кроме того, анализи-

9