Методические указания для выполнения лабораторной работы по теме Определение хлорорганических пестицидов методом тонкослойной хроматографии в воде и продуктах питания по дисциплине Основы экотоксикологии

Методические указания разработаны: к. с.-х. наук, доцентом кафед-

ры агроэкологии и защиты растений В.М. Лапушкиным, ассистентом кафедры химии С.Б. Сафроновым, к. с.-х. наук, ассистентом кафедры аг-

роэкологии и защиты растений Е.В. Пальчиковым

Рецензент:

к. с.-х. наук, ст. преподаватель кафедры маркетинга, коммерции и товароведения, зам. руководителя органа по сертификации при МичГАУ

И.К. Каранян

Рассмотрены на заседании кафедры агроэкологии и защиты растений Протокол № 2 от « 24 » октября 2006 г

Содержание

1.1.Общие положения хроматографии………………………………. 3

1.2.Механизмы разделения веществ в тонкослойной хроматографии ……………………………………………………. 4

1.3.Особенности техники выполнения разделения веществ мето-

2.Лабораторная работа «Определение некоторых хлорорганиче-

ских пестицидов в воде, продуктах питании, кормах методом хроматографии в тонком слое»…………………………………….. 15

3.Литература ………………………………………………………. 21

©Издательство Мичуринского государственного аграрного университета, 2007

2

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

1.ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ХРОМАТОГРАФИИ

ВТОНКОМ СЛОЕ

1.1.Общие положения хроматографии.

Хроматографический метод анализа (от греч. хроматос —

цвет) разработан русским ботаником М. С. Цветом в 1903 г. Хроматография – это физико-химический метод разделения

веществ, основанный на распределении компонентов между дву- мя фазами — неподвижной и подвижной. Неподвижной (стацио- нарной) фазой обычно служит твердое вещество (его часто назы- вают сорбентом) или пленка жидкости, нанесенная на твердое вещество. Подвижная фаза представляет собой жидкость или газ, протекающий через неподвижную фазу.

В отличие от ряда других методов, основанных на распреде- лении компонентов между фазами, хроматография — это дина- мический метод, обеспечивающий многократность актов сорб- ции—десорбции разделяемых компонентов, так как разделение происходит в потоке подвижной фазы. Этим обусловлена боль-

шая эффективность хроматографического метода по сравнению с методами сорбции и экстракции в статических условиях.

Сорбцией (от лат. – sorbeo – поглощаю) называют процесс поглощения твердым телом или жидкостью (сорбентом) газооб- разного или растворенного вещества (сорбата), обратный процесс называют десорбцией. Сорбцию подразделяют на адсорбцию - поглощение вещества (адсорбата) поверхностью твердого или жидкого адсорбента и абсорбцию — поглощение вещества (аб- сорбата) поверхностью абсорбента. Поглощение вещества сор- бентом с образованием химических соединений называют хемо- сорбцией (химической сорбцией).

Вещество подвижной фазы непрерывно вступает в контакт с новыми участками сорбента и частично сорбируется, а сорбиро-

ванное вещество контактирует со свежими порциями подвижной фазы и частично десорбируется.

3

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

По способу ведения •••••••••• ••••••••••• ••••••••••• (••••••••, ••••••-

процесса

••••••)

Характерная особенность всех видов хроматографии – мно- гократность повторения элементарных процессов, например сорбции-десорбции, экстракции-реэкстракции и др. Это обуслов-

ливает высокую эффективность хроматографических методов для разделения близких по химическим свойствам элементов.

1.2. Механизмы разделения веществ в тонкослойной хроматографии.

По механизму процесса разделения смеси компонентов вы- деляют основные виды тонкослойной хроматографии: адсорбци- онную и распределительную.

На рисунке 2 показано два основных механизма: адсорбци- онный и равновесного распределения.

4

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Вещество ● с большим срод-

ством к сорбенту остается преимущественно на поверх-

ности стационарной фазы (адсорбция) (А) или в ста-

ционарной жидкой фазе (распределение) (В); Веще-

ство О с большим сродством к растворителю остается преимущественно в подвиж- ной фазе.

Закрепленные твердой или жидкой стационарной фазой вещества возвраща- ются в подвижную фазу; она

перемещается дальше по слою стационарной фазы, вместе с разделяемыми ве- ществами; снова компонент ● преимущественно закреп- ляется в стационарной твер- дой (А) или стационарной жидкой фазе (В). Молекулы О, мигрируют быстрее, чем молекулы вещества ●.

После многократных повторений процесса веще- ства разделяются и форми- руется хроматограмма.

Рис.2. Равновесие в хроматографическом процессе: Адсорбция (А) и рас- пределение (В). П - подложка для слоя (стекло, алюминиевая фольга); С — поверхность стационарной фазы; ПФ — подвижная фаза;

СЖФ — стационарная жидкая фаза.

5

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

Механизм распределительной хроматографии (чаще всего бумажная хроматография) реализуется в результате различий растворимости анализируемого вещества в двух несмешиваю- щихся фазах - стационарной жидкой, нанесенной на твердый суб- страт, и подвижной фазе. При этом носитель (сорбент) удержива- ет на своей поверхности только одну из жидкостей, которая слу- жит неподвижным растворителем. Вторая жидкость, несмеши- вающаяся с первой, играет роль подвижного растворителя.

Инертными носителями в распределительной хроматогра- фии служат селикагель, кремнезем, оксид алюминия, крахмал, фильтровальная бумага (в бумажной хроматографии). Неподвиж- ными растворителями обычно бывают – вода, этанол, и некото- рые другие полярные жидкости, а подвижными растворителями – малополярные жидкости: бутанол, пентанол, ацетон и т.п.

Компоненты смеси будут элюироваться подвижной фазой и перемещаться по слою сорбента в порядке увеличения их коэф- фициентов распределения между фазами, в результате чего осу-

ществляется разделение смеси на индивидуальные вещества (пятна), т.е. образуется хроматограмма.

1.3. Особенности техники выполнения разделения веществ методом тонкослойной хроматографии (ТСХ).

Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), получивший в настоящее время широкое распространение, был разработан Н. А. Измайловым и М. С. Шрайбер еще в 1938 г. В методе ТСХ не- подвижная твердая фаза тонким слоем наносится на стеклянную, металлическую или пластмассовую пластинку. В 2—3 см от края

пластинки на стартовую линию вносят пробу анализируемой жидкости и край пластинки погружают в растворитель, который действует как подвижная фаза жидкостной адсорбционной хро- матографии (элюент от лат. eluo — вымываю). Под действием

капиллярных сил растворитель движется вдоль слоя сорбента и с разной скоростью переносит компоненты смеси, что приводит к их пространственному разделению. Диффузия в тонком слое

6

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

происходит в продольном и поперечном направлениях, поэтому процесс следует рассматривать как двумерный.

Бумажную и тонкослойную хроматографию можно исполь- зовать для количественного анализа смесей. Для этого на старто- вую линию наносят в виде пятна или полосы точный объем рас- твора пробы при известной концентрации. Нанесение раствора осуществляют микропипетками, микрошприцами или специаль- ными приспособлениями. При нанесении пробы стремятся, чтобы в ней содержалось не менее 20...500 мкг определяемого вещества (в зависимости от методики количественного определения).

Состав тонкого слоя выбирают с учетом состава анализи- руемой пробы. Компоненты смеси должны разделяться друг от- носительно друга достаточно полно, отдельные зоны не должны перекрываться. При выборе состава неподвижной фазы следует учитывать полярности сорбента и разделяемых веществ.

3

На приготовленные хроматографические пластинки наносят линии старта и финиша. На линии старта выбирают точки для каждой пробы или стандартного вещества на расстоянии 1,5 см от ее нижнего края, финишную линию обозначают на удобном расстоянии от стартовой точки. Точки и линию старта наносят мягким графитовым (нехимическим!) карандашом, стараясь не

7

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

повредить слой адсорбента в месте нанесения пробы, поскольку это может привести к деформации пятен или загрязнению посто- ронними соединениями.

Анализируемый раствор наносят на пластинку в точку на линии старта с помощью градуированного микрошприца или микропипетки. Как правило, наносимый объем составляет 1-5 мм3(мкл). Пробу следует растворять в легко испаряющихся рас- творителях, чтобы размер пятна на пластине был минимальным. Применяют достаточно концентрированные пробы, поскольку для проявления пятно должно содержать 0,5 - 10 мкг определяе- мого вещества.

После удаления избытка растворителя пластинку помещают в камеру для хроматографирования - плотно закрывающийся стеклянный сосуд с плоскими стенками. Для получения воспро-

изводимых результатов хроматографирования в камере создают атмосферу, насыщенную парами растворителя (подвижная фаза). Для этого в камеру помещают, располагая вдоль стенки, фильт- ровальную бумагу. Бумага пропитывается находящимся на дне камеры растворителем (восходящий вариант ТСХ). Создание на- сыщенной атмосферы необходимо для устранения "краевого эф- фекта" - перемещения пятен, находящихся по краям пластинки со скоростью, заметно отличающейся от скорости пятен, нанесен- ных в середину хроматограммы.

Известно несколько вариантов ТСХ, различающихся спосо- бом подачи растворителя. Наиболее распространенным является восходящее элюирование. Растворитель помещают на дно хрома- тографической камеры, нижний край пластинки с нанесенными пробами медленно пропитывается подвижной фазой. Фронт хро- матографирования перемещается снизу вверх.

Нисходящий вариант ТСХ применяют в анализе проб, ком- поненты которых медленно перемещаются по слою (аминокисло- ты). Растворитель подают на пластинку из специального устрой- ства сверху. К капиллярным силам добавляется сила гравитации. Таким способом достигается лучшее разделение, чем при восхо- дящем элюировании.

8

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

4

5

Для решения задач, связанных с разделением сложных сме- сей, применяют двухмерную хроматографию. Исследуемую смесь разделяют одним растворителем, затем полученные зоны

отдельных компонентов обрабатывают другим растворителем в перпендикулярном к первоначальному направлению. В результа-

те действия двух различных элюентов происходит значительно более полное разделение смеси.

При выборе элюента следует руководствоваться элюотроп- ным рядом, в котором растворители расположены по возраста- нию элюирующей эффективности, а также данными о свойствах разделяемых веществ и их способности взаимодействовать с под- вижной и неподвижной фазами. Выбор растворителя аналогичен выбору состава элюента в колоночной хроматографии. Не реко- мендуется применять многокомпонентные смеси, предпочти- тельней одно- или двухкомпонентные элюенты, это улучшает воспроизводимость получаемых данных.

После разделения компонентов хроматографическую пла- стинку извлекают из камеры и просушивают (под тягой в су- шильном шкафу) для удаления избытка подвижной фазы, затем

9

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com

хроматограмму проявляют. Окрашенные компоненты смеси чет- ко видны на пластинке после разделения. Неокрашенные соеди- нения обнаруживают различными способами. Если хроматограм- му поместить в йодную камеру (сосуд с кристаллами иода), то

компоненты смеси проявляются в виде коричневых пятен или же проводят иное химическое проявление опрыскивая реагентами с помощью пульверизатора.

Затем хроматографируют и количественно определяют ве- щества в полученных пятнах или полосах. Используют несколько способов определения компонентов пробы: по площади зон, по- лученных на хроматограмме; по измерению физических и физи- ко-химических свойств зон на хроматограмме; экстрагированием зоны соответствующим растворителем и анализом экстракта.

Определение по площади зон основано на явлении насыще- ния слоя адсорбента или бумаги веществом. Каждый тип адсор-

бента имеет определенную емкость и не может адсорбировать в единице массы больше определенного количества вещества. При хроматографировании неадсорбированная часть вещества пере- ходит в подвижную фазу и поступает на свободные участки ад- сорбента. Вещество распределяется на хроматограмме на площа- ди, пропорциональной его массе (рис. 3). Зависимость между массой вещества q и площадью пятна S на хроматограммах пред- ставляет собой логарифмическую функцию:

S = a ×lgq +b

где a и b -коэффициенты

Эта зависимость линейна для количества вещества от 1 до

80... 100 мкг.

При таком методе для исключения больших ошибок приме- няют стандартные растворы, определенные объемы которых с помощью микропипетки наносят на хроматограмму, стремясь получить серию пятен с различным содержанием стандарта. На

эту же хроматограмму наносят определенный объем раствора пробы. Осуществляют хроматографирование, подсушивают хро- матограмму, обрабатывают ее раствором реактива, подсушивают снова и измеряют площадь зон.

10

PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com