Кузнецова Т.Ш.. Морфологические и функциональные изменения при овариогистероэктомии у собак с пиометрой

На правах рукописи

Кузнецова Татьяна Шамильевна

Морфологические и функциональные изменения при

овариогистероэктомии у собак с пиометрой

Специальность 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата

биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре оперативной хирургии с основами топографической анатомии

ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Министерства сельского хозяйства РФ

Капустин Роман Филиппович,

доктор биологических наук, профессор кафедры морфологии и физиологии ФГБОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Я. Горина»

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский Университет Дружбы народов»

Защита диссертации состоится «___»__________ 2013 г. в ______ часов на заседании

Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.042.02 при ФГБОУ ВПО

«Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д.23; тел.377-93-83

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московская

государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина»

Автореферат разослан «___»________ 2013 г.

Автореферат размещен на сайте Министерства образования и науки РФ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы. В общей структуре заболеваемости собак патологии репродуктивной системы составляют от 5,7% (Волков П.А., 2005) до 12 – 20% (Федин A.A., 2005; Шафикова А.В., 2006, Емельянова Н.С., 2007). У животных старшего возраста они приводят в 8,82 % случаев к летальному исходу (Кудряшов А.А. с соавт., 2007).

Впоследние годы неуклонно возрастает частота воспалительных заболеваний репродуктивной системы у сук. В России за последние 5 лет инцидентность этой патологии увеличилась на 45% и продолжает расти (Карташов С.Н., 2005; Кудряшов А.А., 2006, Чулкова Г.Б., 2007). Среди всех гинекологических заболеваний на долю пиометры приходится более 60 % (Лебедев А.В. с соавт., 2000).

Согласно современным представлениям о ходе гиперпластических и воспалительных заболеваний в репродуктивной сфере молекулярную основу патогенеза составляют не только гормон-зависимые, но и другие биологические процессы (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С.,2008, Петров А.М., Аржаев А.М., 2009, Киселев В.И. с соавт., 2010). Это обусловило необходимость изучения не только гормональных нарушений, но также иммунобиологических и биохимических изменений при этих патологических состояниях.

Особенностям морфофункционального статуса органов репродукции у собак посвящены работы Дюльгера Г.П. (2002), Зуевой Н.М. (2003), Слесаренко Н.А. (2004). Вместе с тем изучение изменений репродуктивной системы, происходящих при разных патологиях, актуально и на сегодняшний день.

Особый интерес вызывает система цитокиновой регуляции защитных механизмов организма при септических процессах в репродуктивных органах. Цитокины (интерлейкины, хемокины, лимфокины, монокины, интерфероны и др.) относятся в настоящее время к числу наиболее изучаемых биологически активных молекул. Они играют важную роль в патогенезе многих заболеваний, оказывая существенное влияние на формирование и ход различных процессов в органах и тканях (Borich L.C., Steinke J.W., 2003), осуществляя координацию и взаимосвязь между нервной, эндокринной и иммунной системами организма (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008). Однако их роль в патогенезе пиометры у собак изучена недостаточно и требует дополнительных углубленных научно-практических изысканий.

Вдоступной отечественной и зарубежной литературе практически отсутствуют сведения, касающиеся роли цитокинов в развитии пиометры у собак, о наличии корреляционных связей между провоспалительными и противовоспалительными

цитокинами, а также о динамике гематологических, биохимических показателей и некоторых цитокинов в ранний послеоперационный период.

Расшифровка патогенеза воспалительных процессов даст возможность выбрать оптимальный метод лечения, определить временные интервалы, а также профилактировать заболевания репродуктивной сферы.

Цели и задачи исследования. Цель исследования - оценить морфологические и функциональные изменения организма при пиометре и ее оперативном лечении у собак.

Для реализации поставленной цели были определены следующие задачи:

1.Выявить особенности морфологических, биохимических показателей крови у собак при пиометре и их динамику в раннем послеоперационном периоде после овариогистероэктомии.

2.Охарактеризовать особенности гормонального статуса у собак с пиометрой и в динамике раннего послеоперационного периода после овариогистероэктомии.

3.Установить критерии оценки эндогенной интоксикации у собак с пиометрой и в динамике раннего послеоперационного периода.

4.Определить цитокиновый статус и выяснить наличие корреляционных связей между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами при пиометре у сук.

5. Изучить микробный пейзаж влагалища сук при пиометре и после овариогистероэктомии.

6. Определить характер гистологических изменений, происходящих в тканях матки при пиометре у сук.

Научная новизна. Представлена комплексная сравнительная эндокринная, иммунобиологическая, морфологическая, микробиологическая характеристика организма в до- и послеоперационный период при пиометре у собак. При данной патологии выявлены характерные признаки эндогенной интоксикации, выражающиеся в увеличении ее маркеров - фракций средних молекул и лейкоцитарного индекса.

Показаны изменения уровней цитокинов (фактора некроза опухоли, интерлейкина-4 и гамма-интерферона) в сыворотке крови собак при пиометре и их динамика в раннем послеоперационном периоде. Выявлены биологические корреляционные связи между провоспалительными и противовоспалительными цитокинами при пиометре у сук.

Представлены и детализированы данные о состоянии обмена веществ больных животных.

Показано, что морфологическим эквивалентом иммунобиологических нарушений являются деструктивные изменения, происходящие в тканях матки (шейка и рога), которые характеризуются наличием кист, извитых маточных желез, скоплением лимфоцитов в строме эндометрия и миометрия.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработана научная концепция о полиэтиологичности развития пиометры у собак. Показана интегративная роль цитокиновой регуляции защитных механизмов в патогенезе воспалительного процесса. Обоснована необходимость выявления корреляционных связей между цитокинами, которая позволяет оценить физиологическое состояние организма. Выявлено, что маркеры эндогенной интоксикации отражают состояние детоксикационных систем организма. Установлены клинико-морфологические корреляции в развитии пиометры, проявляющиеся в гемодинамических и гормональных сдвигах и сопровождающиеся деструктивными изменениями органов репродукции.

Выявленные показатели могут являться прогностическими тестами течения послеоперационного периода.

Основные положения, выносимые на защиту:

1.Морфологические и функциональные изменения организма при пиометре и ее оперативном лечении у собак.

2.Динамика гематологических, биохимических показателей и уровней цитокинов у собак при пиометре соответствует септическому процессу.

3.Реакции цитокинового статуса и эндогенной интоксикации в раннем послеоперационном периоде, как критерии оценки степени тяжести воспалительного процесса.

Апробация работы. Основные положения диссертации были доложены, обсуждены и получили положительную оценку на:

- 61-й научной конференции молодых ученых и студентов СПбГАВМ (2007г.), - Международной научной конференции, посвященной 200-летию высшего

ветеринарного образования в России и 200-летию СПбГАВМ (2008г.); - Всероссийском Съезде ветеринарных фармакологов и токсикологов аграрных вузов

«Эффективные и безопасные лекарственные средства в ветеринарии» (2009г.);

- Simpozionstiintific international «35 ani de invatamant superior medical veterinar din republica Moldova» (2009г.);

- Международной научной конференции по вопросам ветеринарной хирургии «Внедрение новых технологий в профилактику и лечение хирургической патологии у животных» (2009г.);

- Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава,

Овариогистероэктомию проводили с соблюдением правил асептики и антисептики по общепринятому методу (Магда И.И., 1990).

Клиническое обследование экспериментальных животных проводили в динамике: -до оперативного вмешательства;

-на 3 сутки после овариогистероэктомии;

-на 10 сутки после овариогистероэктомии.

В эти же сроки брали кровь для морфологических и биохимических исследований, определения содержания гормонов, цитокинов, фракций средних молекул. Материалом для гистологических исследований служили ткани матки (шейка и рога), отобранные во время овариогистероэктомии.

Микробиологические исследования производили до овариогистероэктомии и на 7 сутки после нее.

Взятие проб крови у животных производили из подкожной вены предплечья.

Для гематологических исследований в пробу крови добавляли гепарин, из расчета 5 ЕД на 1 мл крови. Гематологические исследования (гемоглобин, эритроциты, лейкоциты, нейтрофилы, эозинофилы, моноциты, базофилы, лимфоциты, тромбоциты) проводили на гематологическом анализаторе MICROS.

Расчет лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ) осуществляли по формуле Я.Я. Кальф-Калифа, в модификации Островского В.К. с соавт. (1983):

, где пл. – плазматические клетки, мц. – миелоциты, ю. – юные

клетки, п. – палочкоядерные нейтрофилы, с.– сегментоядерные нейтрофилы, л. – лимфоциты, м. – моноциты, э. – эозинофилы, б. – базофилы.

Биохимические исследования сыворотки крови проводили в «Клинико-биохимической лаборатории СПбГАВМ». Количество общего белка определяли биуретовым методом, альбумин, α-,β-,γ-глобулины - нефелометрическим методом по Оллу и Маккорду в модификации Карпюка (Пилаева Н.В. с соавт, 2002). Все биохимические исследования были выполнены на биохимическом анализаторе фирмы CLIMAMC-15 (Испания) с использованием готовых наборов реактивов фирмы КлиниТест-ОБК.

Исследования фракций средних молекул выполняли на биохимическом анализаторе «Hospiteх Diagnostics» (Швейцария – Италия) с использованием реактивов этой же фирмы.

Эстрадиол, прогестерон, фолликулостимулирующий гормон определяли на автоматической иммунохемилюминисцентной системе IMMULITE ONE фирмы DPC (США). Тестостерон в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного

анализа (TsangB.K. et all., 1980) на иммуноферментном анализаторе Boehringer Mannheim Immunodiagnostics ES 300 (Германия) с использованием реактивов этой же фирмы

(EnzymeImmunologicaltestinvitro «BoehringerMannheim»).

3. Цитокины (гамма-интерферон, интерлейкин-4, фактор некроза опухоли-альфа) определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа (Рябичева Т.Г. с соавт., 2004) на анализаторе "Мультискан", используя наборы фирмы «Вектор-Бест» (Россия).

Микробиологические исследования проводили в бактериологическом отделе ГУ СПб «Горветлаборатория».

Отбор проб клинического материала из влагалища собак производили согласно методическому пособию (Яшин А.В., 2009).

Видовую идентификацию микроорганизмов осуществляли общепринятыми методами, используя номенклатуру Берджи (Bergey, 1997) и руководство по клинической микробиологии (Бойцов А.Г., 1999).

Для гистологических исследований брали материал из области шейки матки и рогов, фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, проводили через спирты возрастающей крепости и кусочки тканей заливали в гистологическую среду HISTOMIX.

В дальнейшем кусочки фиксировали на деревянных брусках и делали гистосрезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином (Меркулов Г.А., 1969). Для светооптического изучения гистологических срезов использовали микроскоп Leica DMLS2 (Германия), для микрофотографирования цифровую камеру Leica DFC 290 (Германия).

Полученные в результате исследований данные были проанализированы и подвергнуты статистической обработке. Выборки были репрезентативными, различия считали достоверными при р ≤ 0,05.

Чтобы оценить различие средних в двух выборках (подопытная – собаки с пиометрой, контрольная – здоровые самки) использовали параметрический t-критерий Стьюдента (Донелли Р., 2007). Для выяснения являются ли полученные эмпирическим путем распределения нормальными, использовали критерий согласия Колмогорова, обладающий достаточной чувствительностью даже при малом числе значений (Большев Л.Н. с соавт.,

1983).

Корреляционный анализ проводили при помощи коэффициента корреляции Пирсона, который дает возможность выяснить существует ли связь между разными показателями, какова ее мощность и направленность (Лакин Г.Ф, 1990, Ивантер Э.В.с соавт., 2005).

Расчет эмпирических значений коэффициента корреляции (r) проводили в программе Microsoft Excel с использованием функции КОРРЕЛ. Ошибку коэффициента корреляции

рассчитывали по формуле: mr = (Ивантер Э.В. с соавт., 2005, с.66). Эмпирический

критерий t Стьюдента для проверки значимости коэффициентов рассчитывали по формуле:

tr = r/mr. Далее сравнивали полученное эмпирическое значение t-коэффициента Стьюдента с табличным значением для уровня значимости α = 0,05 и числа степеней свободы df = n–2. При tэм .≥ tтаб. разницу считали достоверно значимой.

Расчеты производили в программе Microsoft Excel (Мидлтон М.Р., 2005).

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

В таблице 1 представлены результаты общего клинического анализа крови у собак контрольной и подопытной групп на этапах лечения.

Примечание: СОЭ – скорость оседания эритроцитов, * - достоверные отличия от контроля,

при p ≤ 0,05

При анализе полученных данных мы наблюдали достоверное (p ≤ 0,05) увеличение СОЭ у собак с пиометрой (30,49 ± 1,27 мм/ч) по сравнению с контрольными животными (6,17 ± 0,37 мм/ч). На 3-и сутки после овариогистероэктомии этот показатель оставался попрежнему достоверно (p ≤0,05) выше (28,99 ± 1,14 мм/ч) у подопытных животных по сравнению с контрольными. На 10-е сутки после операции обнаружена тенденция к снижению уровня СОЭ (22,91 ± 2,16 мм/ч), однако он был достоверно выше контрольного показателя (p ≤ 0,05).

Количество гемоглобина у больных собак до операции (99,75 ± 2,83 г/л) было достоверно (p ≤ 0,05) ниже по сравнению со здоровыми животными (161,44 ± 4,73 г/л). На 3- и сутки после операции его значения оставались достоверно (p ≤ 0,05) ниже 100,78 ± 2,28 г/л в сравнении с контролем. На 10-е сутки после операции показатель гемоглобина незначительно увеличился у подопытных особей (109,22 ± 4,74 г/л), но оставался достоверно (p ≤ 0,05) ниже такового у контрольных.

Собаки с пиометрой по количеству эритроцитов достоверно (p ≤ 0,05) уступали здоровым животным 5,14 ± 0,13 1012/л против 6,51 ± 0,28 1012/л. Аналогичная ситуация сохранялась на 3-и сутки послеоперационных наблюдений. Однако на 10-е сутки прооперированные животные не имели достоверных отличий по данному показателю от контрольных аналогов (табл.1).

Следует подчеркнуть, что больные животные достоверно (p ≤ 0,05) превосходили своих контрольных сверстников по количеству лейкоцитов (26,61 ± 1,49 109/л и 7,52 ± 0,35 109/л, соответственно). На 3-сутки после операции количество лейкоцитов у прооперированных животных снизилось (25,42 ± 1,18 109/л) и было достоверно (p ≤ 0,05) выше аналогичного показателя у контрольных особей. Важно отметить, что на 10-е сутки послеоперационного периода значение лейкоцитов (13,89 ± 1,49 109/л) было достоверно выше (p ≤ 0,05) у подопытных животных в сравнении с контролем, но достигло референтного диапазона.

Аналогичная картина была обнаружена по показателям гематокрита. У животных до операции этот показатель (37,85 ± 1,27 %) был достоверно (p ≤ 0,05) выше контрольного значения (20,34 ± 0,62 %). На 3-и сутки после операции гематокрит достоверно (p ≤ 0,05) превышал (36,88 ± 1,31 %) контрольный уровень. На 10-е сутки после операции у подопытных собак его значние (24,17 ± 2,19 %) достоверно не отличалось от такового у контрольных.

Таким образом при анализе гематологических показателей у собак с пиометрой выявлено достоверное (p ≤ 0,05) увеличение лейкоцитов, что характерно для гнойновоспалительных процессов (Кондрахин И.П., 2004). Достоверное увеличение количества эритроцитов у больных животных связано с повышением уровня глобулинов (в частности γ- глобулинов), которые возрастают при многих воспалительных процессах (Кондрахин И.П., 2004). Снижение уровня гемоглобина, а также увеличение гематокрита у собак с пиометрой отражает наличие острого воспалительного процесса и интоксикации организма.

Результаты биохимических показателей сыворотки крови собак с пиометрой до и после овариогистероэктомии в сравнении со значениями здоровых самок отражены в таблице

2.

Таблица 2. Биохимические показатели сыворотки крови собак с пиометрой на этапах лечения (M ± m).

Примечание: ЩФ — щелочная фосфатаза, достоверные отличия от контроля *- р ≤ 0,05.

Из полученных данных следует, что показатель общего белка подопытных собак (70,69 ± 1,04 г/л) достоверно (p ≤ 0,05) превышал уровень контрольных (63,00 ± 2,83 г/л). На 3-и сутки после оперативного вмешательства уровень общего белка оставался без изменений (71,69 ± 1,21 г/л), достоверно (p ≤ 0,05) превышая контрольные значения. На 10-е сутки после операции значение общего белка в опыте снизилось до уровня 66,50 ± 3,14 г/л, что не имело достоверных отличий от контроля.

Уровень альбуминов в сыворотке крови у больных животных (22,61 ± 0,65 г/л) был достоверно (p ≤ 0,05) ниже по сравнению со значениями у контрольных животных (32,68 ± 1,48 г/л). На 3-и сутки после овариогистероэктомии он не отличался в сравниваемых группах. На 10-е сутки после операции значения альбуминов повысились до (26,79 ± 0,73 г/л), но оставались достоверно (p ≤ 0,05) ниже у подопытных животных по отношению к контрольным.

Концентрация билирубина у собак с пиометрой (7,00 ± 1,13 мкмоль/л) была достоверно (p ≤ 0,05) выше относительно контроля (2,58 ± 0,3 мкмоль/л). На 3-и сутки после операции показатель билирубина (6,91 ± 0,09 мкмоль/л) сохранял высокое значение, достоверно (p ≤ 0,05) превышая контрольный уровень. На 10-е сутки после операции билирубин несколько снизился (4,98 ± 0,12 мкмоль/л), но все же был достоверно (p ≤ 0,05) выше у подопытных особей по сравнению с контролем.

У собак с пиометрой уровень креатинина (131,86 ± 3,23 мкмоль/л) достоверно (p ≤ 0,05) превышал таковой у контрольных аналогов (90,56 ± 2,10 мкмоль/л). На 3-и сутки после проведенной овариогистероэктомии он (126,78 ± 3,21 мкмоль/л) достоверно (p ≤ 0,05) превышал контрольный уровень. На 10-е сутки после операции аналогичная картина сохранялась (табл.2).

Концентрация мочевины у подопытных животных (13,18 ± 0,58 ммоль/л) достоверно

(p ≤ 0,05) превышала таковую в контрольной группе (5,00 ± 0,53 ммоль/л). На 3-и сутки после операции значение мочевины (12,66 ± 0,73 ммоль/л) было достоверно (p ≤ 0,05) выше контроля. На 10-е сутки послеоперационного периода уровень мочевины (11,94 ± 0,58 ммоль/л) по-прежнему достоверно (p ≤ 0,05) превышал контроль.

Значения щелочной фосфатазы (ЩФ) у больных собак до операции (125,41 ± 3,40 МЕ/л) были достоверно (p ≤ 0,05) выше таковых в контрольной группе (29,13 ± 2,05 МЕ/л), что сохранялось на 3-и сутки послеоперационных наблюдений (табл. 2). К 10-м суткам наблюдали тенденцию к снижению уровня ЩФ (104,83 ± 3,09 МЕ/л) в подопытной группе, но этот показатель оставался достоверно (p ≤ 0,05) выше чем в группе контроля.

Таким образом, увеличение количества мочевины, креатинина, ЩФ свидетельствует о полиорганной недостаточности, а повышение значений билирубина отражает усиление гемолиза эритроцитов при пиометре у собак.

Значения креатинина, билирубина и мочевины на 10-е сутки после операции хоть и превышали значения контрольных животных, но находились практически на верхних границах референсных интервалов.

Процентное представительство белковых фракций представлено в таблице 3.

Таблица 3. Значения альбумина и глобулинов сыворотки крови у собак с пиометрой на этапах

исследования (M ± m).

Примечание: * - достоверные отличия от контроля (p ≤ 0,05)

Процентное содержание альбуминов у больных собак до операции было достоверно (p ≤ 0,05) ниже (33,03 ± 1,09 %) по сравнению с контрольным значением (44,09 ± 0,99 %). На 3-и сутки (32,21 ± 1,91 %) и 10-е сутки (38,29 ± 1,90 %) после оперативного вмешательства содержание альбуминов было достоверно (p ≤ 0,05) снижено относительно контрольных показателей. Процентное содержание α-глобулинов, β-глобулинов на всех этапах исследования статистически значимых отличий от контроля не имели при p ≤ 0,05.

Иная картина была обнаружена при анализе динамики γ-глобулинов. До операции они (39,78 ± 1,70%) были достоверно (p ≤ 0,05) выше контрольных величин (20,96 ± 1,00 %). На 3-и сутки после операции (32,66 ± 2,17 %) и на 10-е сутки после операции (29,04 ± 1,88 %) значения γ-глобулинов несколько снизились, но были достоверно (p ≤ 0,05) выше контроля.

У собак с пиометрой мы отмечали статистически значимое снижение процентных значений альбумина. Можно допустить, что низкий уровень альбуминов в крови больных животных связан с их вымыванием в результате полиурии, или наличием кровотечения в матке, что нередко при данной патологии, или недостаточной биосинтезирующей активностью печени. Кроме того, альбумин является негативным острофазным белком, вследствие чего при воспалении часто наблюдается слабая протеинемия (Грызунов Ю.А. с соавт., 1998, Мейер Д. с соавт., 2007).

Увеличение γ - глобулинов свидетельствует об активации иммунной системы при пиометре у собак. Достоверное уменьшение содержания γ - глобулинов в сыворотке крови можно объяснить снижением антигенной нагрузки в послеоперационном периоде в связи с удалением основного септического очага.