Волознев Л.В.. Экспериментальная оценка функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Re - золедроновая кислота

Работа выполнена на кафедре радиобиологии и биофизики имени академика РАСХН, профессора А.Д. Белова в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ)

Научный руководитель:

Лысенко Николай Петрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой радиобиологии и биофизики имени академика РАСХН, профессора А.Д. Белова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Официальные оппоненты:

Тихонов Игорь Владимирович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой биотехнологии ФГБОУ ВПО МГАВМиБ

Осипов Андреян Николаевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией радиационной биофизики ФГБУ ГНЦ ФМБЦ имени А.И. Бурназяна ФМБА России

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение «Медицинский радиологический научный центр» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится «30» октября 2013 года в 14.30 на заседании диссертационного совета Д.220.042.04 при ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23; тел.: 8 (495) 377-93-98).

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Автореферат разослан «___» сентября 2013 года и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru/.

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Одним из серьезных осложнений онкологических заболеваний различной локализации, несмотря на современную противоопухолевую терапию, является развитие костных метастазов.

Метастатическое поражение скелета сопровождается ремоделированием пораженных участков кости вследствие стимуляции опухолевой клеткой костного обмена. Патологическое изменение в пораженных участках приводит к стойкому болевому синдрому, нарастающему по мере прогрессирования процесса;

патологическому перелому и, как следствие, инвалидизации. Одним из перспективных методов паллиативной терапии при метастатическом поражении скелета является радионуклидная терапия (РНТ). Преимущества паллиативной терапии костных метастазов радиофармацевтическими препаратами (РФП)

сегодня общеизвестны и не вызывают сомнения – это стойкое и длительное подавление болевого синдрома (до 6 месяцев и более), снижение потребления анальгетиков (или их полная отмена), улучшение качества жизни пациентов

(Рыжков А.Д. и др., 2008; Крылов В.В. и др., 2005, 2006, 2007; Цыб А.Ф и др.,

2006). Главное преимущество радионуклидной терапии заключается в том, что это системное лечение в равной мере воздействует как на манифестирующие, так и на субклинические метастатические очаги. Бисфосфонаты (в том числе золедроновая кислота) как таргетные носители для β-эмиттеров обладают оптимальными характеристиками для доставки изотопа в патологический очаг,

так как известна их высокоселективная тропность к костной ткани. Радионуклид

188Re по своим ядерно-физическим характеристикам соответствует требованиям,

предъявляемым к радионуклиду терапевтического назначения – высокая энергия излучения Emáx = 2,120 МэВ, короткий период полураспада (Т1/2 = 17,0 часов),

способность образовывать комплексы с бисфосфонатами, которые избирательно накапливаются в очагах ремоделирования кости. Все эти факторы делают комплекс золедроновой кислоты и рения-188 перспективным для терапии метастатического поражения скелета. По сравнению с традиционно использующимися радиофармацевтическими препаратами, такими как 153Sm-

4

EDTMP, 89SrCl2, свойства 188Re-золедроновой кислоты позволяют избежать излишней миелотоксичности и получить высокие поглощенные дозы непосредственно в метастатических очагах. При этом возможно использовать высокую терапевтическую активность, что предполагает более раннее наступление паллиативного эффекта (Liepe K., 2007; Silberstein E.B., 2003; Lin W.Y., 1997). Необходимость проведения экспериментов по оценке безопасности и функциональной пригодности радиофармацевтического препарата 188Re-

золедроновая кислота обусловлена отсутствием исследований в мировой литературе, посвященных РФП на основе 188Re. Анализ состояния проблемы эффективности радионуклидной терапии в комплексном лечении метастатического поражения костной системы при злокачественных новообразованиях различной локализации подтверждает необходимость внедрения новых радиофармпрепаратов, обладающих высокой специфичностью накопления в патологическом очаге.

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключается в экспериментальной оценке функциональной пригодности и безопасности радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота.

Исходя из поставленной цели, необходимо решить следующие задачи:

1. Изучить распределение радиофармацевтического препарата 188Re-

золедроновая кислота в организме крыс с моделью костной патологии.

2. Определить лучевые нагрузки и поглощенные дозы на органы и ткани при эквивалентном перерасчете на человека; определить соотношение «польза–риск» для применения в клинической практике.

3. Изучить безопасность препарата 188Re-золедроновая кислота и компонентов для приготовления радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота на экспериментальных животных.

5

4. Изучить аллергезирующие и иммунологические свойства лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота.

Научная новизна. Впервые определены поглощенные дозы 188Re-

золедроновой кислоты на органы и ткани у экспериментальных животных при эквивалентном пересчете на человека. Расчетные данные о лучевых нагрузках

188Re-золедроновой кислоты предполагают достижение высокой поглощенной дозы в патологическом очаге при низких лучевых нагрузках на интактные ткани.

Впервые определен коэффициент соотношения «польза–риск» радиофармацевтического препарата для паллиативной терапии скелета для применения в практике. Исследован характер биораспределения, а также получены данные эффективного периода полувыведения 188Re-золедроновой кислоты; показано специфическое накопление препарата в очагах ремоделирования кости на экспериментальной модели костной патологии.

Впервые для оценки безопасности применения радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота изучены радиотоксические свойства и токсичность его компонентов в виде раствора лиофилизата для приготовления РФП на экспериментальных животных. На основании результатов гематологических, биохимических, морфологических и гистологических исследований радиофармацевтический препарат 188Re-золедроновая кислота охарактеризован как безопасный в терапевтической дозировке/активности, что позволяет рекомендовать препарат для проведения клинических исследований.

Теоретическая и практическая значимость исследований. Показана возможность применения радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота для паллиативной терапии метастатического поражения скелета.

Теоретически обосновано и экспериментально доказано остеотропное распределение препарата 188Re-золедроновая кислота в организме крыс,

безопасность его применения. Результаты исследований 188Re-золедроновой кислоты используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении лабораторно-практических занятий в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, при производстве

6

и проведении клинических исследований в фармацевтическом предприятии ЗАО

«Фарм-Синтез» (г. Москва, Россия).

Положения, выносимые на защиту

1.Радиофармацевтический препарат 188Re-золедроновая кислота обладает выраженной остеотропностью, высокой скоростью выведения из организма и специфическим накоплением в очаге ремоделирования кости.

2.Лучевые нагрузки на органы и ткани не превышают предельно допустимых значений. Расчетные данные поглощенной дозы в экспериментальном патологическом очаге (7,8±5,3 мГр/МБк) предполагают достижение паллиативного эффекта при проведении радионуклидной терапии.

3.188Re-золедроновая кислота с активностью 45,0 МБк/кг при внутривенном введении крысам оказывает относительную миелосупрессию обратимого характера.

4.Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофилизата при однократном введении до 6 мг/кг и многократном введении до

0,6 мг/кг по основному веществу (золедроновой кислоте) не вызывают токсических изменений в организме крыс.

5. Компоненты радиофармацевтического препарата в виде раствора лиофилизата стимулируют неспецифический иммунный ответ организма мышей за счет повышения фагоцитарной активности макрофагов.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на заседании секции радиобиологии отделения ветеринарной медицины РАСХН

(г. Москва, 2012 г.); основные положения диссертации были представлены и обсуждены на следующих научных форумах: 7-я Международная конференция по радиофармацевтической терапии (г. Леви, Финляндия, 2012 г.), Международная научно-практическая конференция «Рений. Научные исследования,

технологические разработки, промышленное применение» (г. Москва, 2013 г.).

7

Личный вклад автора. Разработка методов и экспериментальные исследования, представленные в диссертации, проводились либо лично автором,

либо при непосредственном участии автора. Изучение биораспределения радиофармацевтического препарата было осуществлено совместно с канд. биол.

наук Клементьевой О.Е., под руководством докт. мед. наук, профессора Корсунского В.Н.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 научных статей,

все в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов исследований,

заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 179 источников, из них 119

зарубежных авторов.

Материалы и методы собственных исследований. Работа выполнена на кафедре радиобиологии и биофизики имени академика РАСХН, профессора А.Д. Белова ФГБОУ ВПО МГАВМиБ при сотрудничестве с лабораторией по доклиническому и клиническому исследованию радиофармацевтических препаратов ФГБУ ГНЦ ФМБЦ имени А.И. Бурназяна ФМБА России.

Экспериментальные исследования были проведены с соблюдением общепринятых принципов, международных нормативных документов и инструкций МЗ РФ и РАМН по работе с лабораторными животными.

Эксперименты проводились на 139 беспородных крысах, самцах и самках, массой

180-270 г, 30 морских свинках массой 250-300 г, 50 нелинейных мышах весом 20-

25 г, 30 мышах-гибридах (CBAC57BL/6)F1 массой 20-25 г. Животных содержали при температуре 20-22ºС, влажности не более 50%, в стандартных железных клетках с мелкой древесной стружкой. Содержание и кормление осуществляли согласно «Правилам проведения работ с использованием экспериментальных

8

животных».

В экспериментах на животных для оценки функциональной пригодности и

радиотоксических свойств РФП 188Re-золедроновая кислота был использован в

виде раствора для внутривенного введения с объемной активностью 35-200

МБк/мл.

Таблица 1. Состав лиофилизата для приготовления радиофармацевтического препарата 188Re-золедроновая кислота

Активное вещество

Изучение функциональной пригодности препарата 188Re-золедроновая кислота проводилось на модели костной патологии ремоделирования кости (костная мозоль) и основывалось на определении динамики распределения 188Re-

золедроновой кислоты; расчете эффективных и биологических периодов полувыведения препарата из органов и тканей крыс. В эксперименте было использовано 15 крыс массой 180-230 г. Всем животным препарат 188Re-

золедроновая кислота вводился в хвостовую вену с активностью 45 МБк/кг

(золедроновая кислота 0,3 мг/кг, согласно эквивалентному перерасчету с человека

на крысу). Через 1, 3, 5, 24 и 48 часов проводилась эвтаназия животных, после

чего в органах и тканях определялось содержание РФП методом прямой радиометрии. Полученные результаты рассчитывали в процентах от введенного количества на орган и на 1 грамм ткани. Костная патология имитировалась

9

переломом большеберцовой кости, манипуляции с животными проводились под хлоралгидратным наркозом (400 мг/кг, в/б). В течение последующих 14 дней после создания закрытого перелома формировалась костная мозоль, которая и служила моделью костной патологии.

Исследование радиотоксических свойств 188Re-золедроновой кислоты проводилось в соответствии с «Руководством по экспериментальному

(доклиническому) исследованию новых фармакологических веществ» (М., 2005,

с. 729-741) на 30 самках беспородных крыс массой 190-210 г. Крысам экспериментальной группы в хвостовую вену ежедневно один раз в день в течение 3 суток вводился исследуемый препарат с активностью 15 МБк/кг/сут. (золедроновая кислота 0,3 мг/кг, согласно эквивалентному перерасчету с человека на крысу). Срок наблюдения 30 суток. Суммарная активность 45 МБк/кг была выбрана на основании клинических исследований безопасности 188Re-

этидроновой кислоты (Palmedo H. et al., 2000; Liepe К. et al., 2003), как приемлемая по соотношению «риск–польза».

Радиотоксичность оценивалась по общему состоянию, клиническому и биохимическому анализам крови в динамике до опыта, на 5, 10, 15, 20 и 30 сутки после введения препарата; патологоанатомическому исследованию с макро- и

микроскопической оценкой состояния внутренних органов.

В экспериментах на животных для оценки токсических, аллергологических и иммунотоксических свойств компонентов РФП использовался 0,9% NaCl раствор лиофилизата.

Исследование токсичности лиофилизата для приготовления 188Re-

золедроновой кислоты проводилось на 64 беспородных крысах-самцах массой

180-270 г при однократном и многократном внутрибрюшинном способе введения в различных дозировках и однократном внутривенном способе введения на 20

нелинейных мышах массой 20-25 г. Для изучения токсичности при однократном введении животные были распределены на группу контроля и экспериментальные группы с увеличением вводимой дозировки по основному веществу

(золедроновая кислота): 3,0 мг/кг, 6,0 мг/кг, 9,0 мг/кг, 12,0 мг/кг и 15,0 мг/кг, по 4

10

крысы в каждой группе. Срок наблюдения составлял 14 суток. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию и патоморфологической оценке внутренних органов. Для изучения токсичности при многократном введении животные были распределены на группу контроля и следующие экспериментальные группы (по 10 крыс в каждой группе): вводимая дозировка по основному веществу составляла 0,3 мг/кг, 0,6 мг/кг и 3,0 мг/кг. Препарат вводился ежедневно в течение 5 суток. Срок наблюдения составлял 21 день. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию, клиническому и биохимическому анализам крови, патологоанатомическому исследованию с макро- и микроскопической оценкой состояния внутренних органов до начала исследования и на 7 и 21-е сутки. Для изучения токсичности животные были распределены по группам: контрольная и экспериментальная (5,4 мг/кг по основному веществу является максимально вводимой дозировкой для мышей,

ограниченная объемом вводимого раствора). Срок наблюдения составлял 14

суток. Токсичность оценивалась по выживаемости, общему состоянию и патоморфологической оценке внутренних органов.

Для клинического анализа кровь отбиралась в специальные пробирки

«Юнивет» с антикоагулянтом ЭДТА. Анализы проводились на гематологическом анализаторе «Медоник» для ветеринарии (Швеция). Для биохимических анализов кровь отбиралась в специальные пробирки с гранулами для отделения сыворотки.

Биохимические анализы проводились унифицированными методами на биохимических фотометрах «Стат факс 1904+» и «Стат факс 4500+» (США) с

использованием стандартных наборов реагентов UTS фирмы «Юнимед».

Морфометрическая оценка параметров органов животных осуществлялась с помощью весов «Vibra» (Shinko Denshi Cо. Ltd, Япония). Для гистологических исследований органы и ткани фиксировали в забуферном 10%-ном растворе нейтрального формалина, дегитратировали в спиртовых растворах с возрастающей концентрацией и заливали в парафин по общепринятой методике,

окраска гематоксилин-эозином. Аллергологические свойства оценивались при изучении активной кожной анафилаксии на морских свинках весом 250-300 г,