Задание 7. Определение изоэлектрической точки белков

Оборудование и реактивы: сухие препараты растительных белков; пипетки на 1 мл и 10 мл градуированные; мерные цилиндры на 100 мл; колбы на 100 мл; пробирки в штативах; водяная баня; 0,1 Н р-р CH₃COOH; 0,01 Н р-р CH₃COOH; 0,5 Н р-р CH₃COONa.

В состав белков входят аминокислоты- моноаминодикарбоновые (аспарагиновая, глутаминовая) и диаминомонокарбоновые (аргинин, лизин, гистидин). Первые придают молекулам белков отрицательный заряд, а вторые – положительный. В большинстве белков преобладают остатки аспарагиновой и глутаминовой кислот, поэтому в нейтральной среде молекулы белков заряжены отрицательно.

При подкислении раствора белка постепенно подавляется диссоциация карбоксильных групп, и в определенный момент число положительных и отрицательных зарядов в молекуле оказывается равным. При дальнейшем подкислении раствора число отрицательных зарядов еще больше уменьшается, молекула белка приобретает положительный заряд.

pH раствора, при котором в молекуле белка число положительных зарядов равно числу отрицательных, называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). У большинства белков ИЭТ лежит в области 5,5-5,6. Некоторые белки (протамины, гистоны), в составе которых преобладают лизин и аргинин имеют ИЭТ равную 8-9. По величине ИЭТ можно составить некоторое представление об аминокислотном составе данного белка.

Раствор, pH которого равно ИЭТ данного белка, молекулы белка электронейтральны и поэтому легко слипаются и выпадают в осадок. В растворах со значением pH больше или меньше ИЭТ белки имеют соответственно отрицательный или положительный заряд, что препятствует их осаждению.

Для определения ИЭТ необходимо найти pH того раствора, в котором белок легко выпадает в осадок.

Ход работы

Отвешивают по 0,1-0,2 г различных белков (лучше использовать подготовленные заранее сухие препараты альбуминов, глобулинов и проламинов). Навески растворяют при слабом нагревании на водяной бане в 5 мл 0,5 н CH₃COONa. Раствор доводят водой до 25 мл, тщательно перемешивают и берут по 1 мл его в 8 сухих пробирок. В каждую из этих пробирок вносят соответствующее количество воды и уксусной кислоты, которые указаны в таблице:

Наименование реактива	№ пробирок и количество реактива, мл
	1	2	3	4	5	6	7	8
Вода	8.4	7.75	8.75	8.5	8.0	7.0	5.0	1.0
0,01 Н CH3COOH	0.6	1.25
0,1 Н CH3COOH	-	-	0.25	0.5	1.0	2.0	4.0	8.0
Р-р белка	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0	1.0
Величина pH в пробирке	5.9	5.6	5.3	5.0	4.7	4.4	4.1	3.8

В растворе, pH которого равен или почти равен ИЭТ данного белка, происходит его осаждение, что легко наблюдать по появлению мути в соответствующей пробирке. Для ускорения осаждения белка можно все пробирки подогреть на водяной бане при 70-80⁰С. Результаты определения записать в таблицу:

Вид белка	№ пробирки с осадком	ИЭТ белка
Альбумины
Глобулины
Проламины