54

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

ФГОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет им. К.Д. Глинки»

Технологический факультет

Кафедра биохимии и микробиологии

Методические указания

Для выполнения лабораторных работ

по курсу «Биохимия растений»

Для специальности № 311200 «Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции»

Воронеж 2005

Составители:

доценты Мараева О.Б., Юрьев А.Н., Ухина Е.Ю.

Рецензент:

доцент, к.б.н. Кузьмичева В.Н., ВГАУ

Методические указания рассмотрены и рекомендованы к изданию на заседании кафедры биохимии и микробиологии (протокол №6 от 6.03.2005г.)

Методические указания рекомендованы к изданию на заседании методической комиссии технологического факультета (протокол №6 от 31.03.2005г.)

СОДЕРЖАНИЕ

Цветные реакции на белки. Денатурация.	4
Определение белка по биуретовой реакции	5
Определение триптофана в зерне с/х растений	6
Определение аминокислот методом ТСХ.	7
Определение количества аминного азота методом формольного титрования	11
Выделение проламинов из зерна злаков	13
Определение изоэлектрической точки белков	14
Специфичность действия ферментов	17
Определение оптимальных значений рН для различных ферментов	19
Влияние температуры на активность ферментов	21
Обнаружение каталазы и пероксидазы в растительных объектах	22
Определение активности тирозиназы	23
Определение активности каталазы	24
Цветные реакции на сахара	26
Йодометрический метод количественного определения редуцирующих сахаров	27
Свойства моносахаридов и дисахаридов, ферментативный гидролиз сахарозы	28
Цветные реакции на полисахариды	31
Определение сахарозы в сахарной свекле на поляриметре	33
Физико-химические свойства жиров	35
Определение констант жиров	38
Качественные реакции на жирорастворимые витамины Е	41
Качественные реакции на водорастворимые витамины группы В и витамин	42
Определение содержания аскорбиновой кислоты в растениях	44
Определение общей кислотности	47
Определение свободных органических кислот	49
Определение нитратного азота потенциометрическим методом	51

АМИНОКИСЛОТЫ, БЕЛКИ, ФЕРМЕНТЫ

Белки – макромолекулы, состоящие из одной или нескольких полипептидных цепей. Они являются основными компонентами всех живых клеток. Важнейшие проявления жизни – питание, раздражимость, рост, размножение, движение – вытекают из свойств белковых веществ. В состав белка входят до 22 аминокислот.

Задание 1. Цветные реакции на белки. Денатурация

Оборудование и реактивы: пробирки, мерные пипетки на 1 – 5 мл, водяная баня, концентрированные НNO₃, HCl, 10% раствор NaOH, 1% раствор медного купороса, 5 % раствор уксуснокислого свинца, 0,1% ацетоновый раствор нингидрина, концентрированный раствор аммиака.

Материалы: раствор белка из гороховой муки, раствор белка куриного яйца.

При осаждении крепкими минеральными кислотами, солями тяжелых металлов, под действием высокой температуры белки подвергаются денатурации. Денатурация – изменение внутреннего строения полипептидных цепей, разрыв некоторых связей и переход белка в другое качественное состояние: из растворимого в нерастворимое, а также потеря им ферментативной активности.

1. К 2-3 мл раствора белка прибавляют кристаллическую NaCI; помутнение раствора свидетельствует о выпадении белка в осадок. Добавляют воду и наблюдают за обратимостью реакции высаливания.

2. 2-3 мл раствора белка нагревают до кипения.

3. К 2-3 мл раствора белка добавляют крепкую HNO₃. Пронаблюдать за явлением денатурации.

4 Биуретовая реакция обусловлена наличием пептидных связей в молекуле белка, благодаря которым в щелочной среде с солями меди белок образует цветную комплексную соль. К одному мл раствора белка добавляют 1 мл 10 %-ного раствора NaOH и 1 –2 капли 1% -ного раствора CuSО₄ . Появляется фиолетовое окрашивание.

5.Ксантопротеиновая реакция основана на способности присутствующих в молекуле белка ароматических аминокислот тирозина, триптофана, фенилаланина образовывать с концентрированной азотной кислотой при подогревании жёлтоокрашенные нитросоединения. К 1 мл раствора белка приливают под тягой 0,5 мл концентрированной азотной кислоты. Выпадает осадок, который при нагревании приобретает жёлтую окраску.

6. Реакция на триптофан. К 1 мл раствора белка в разведении 1:10 приливают избыток концентрированной HCl и нагревают не доводя до кипения. Белок, выпавший при добавлении

кислоты в осадок, при подогревании растворяется, и жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

7. Реакция с уксуснокислым свинцом указывает на наличие в белковой молекуле атомов серы цистеина и цистина. К 1 мл раствора белка добавляют двойной объём 10%-ного раствора NaOH, перемешивают, кипятят 2-3 мин, затем прибавляют 1-2 капли 5% -ного раствора уксуснокислого свинца и продолжают нагревать до выпадения чёрного осадка PbS.

8. Нингидриновая реакция указывает на присутствие в аминокислотах α-аминогрупп. К 0,2-0,5 мл раствора аминокислоты прибавляют 2-3 капли 0,1% - ного ацетонового раствора нингидрина и кипятят 2 мин. Появляется сине-фиолетовое окрашивание вследствие взаимодействия двух молекул нингидрина с аминокислотой.

Проделать предложенные реакции и записать выводы.

Задание 2. Определение содержания белка по биуретовой реакции

Оборудование и реактивы. ФЭК, пипетки на 1-5 мл, пробирки.

Биуретовый реактив: растворяют в 250 мл воды 0,75 г медного купороса и 3г калия-натрия виннокислого, затем при помешивании добавляют 150 мл 10% -ного раствора NaOH, свободного от Na₂CO ₃, и 1г KI для предотвращения самопроизвольного восстановления, объём раствора доводят водой до 1 л.

Материалы: 1 % -ный водный раствор яичного альбумина.

Ход работы:

К 1мл исследуемого раствора, содержащего 1-10 мг белка, прибавляют 4 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют стоять 30 мин при комнатной температуре. По истечении указанного времени колориметрируют при длине волны 540 нм против воды. Содержание белка рассчитывают по калибровочной кривой, составленной для альбумина: В серию пробирок вливают 0,1; 0,25; 0,5 и 1 мл 1% - ного раствора яичного альбумина, содержащего от 1 до 10 мг белка, доводят объём раствора дистиллированной водой до 1 мл, перемешивают, добавляют в каждую пробирку по 4 мл биуретового реактива и через 30 мин колориметрируют.