4.2. Отбор каллусов на резистентность к культуральным фильтратам фитопатогенных грибов

Каллусы земляники высаживают на селективные среды и культиви­руют в течение 30-45 суток. Затем отбирают каллусы, сохранившие способность к росту в селективных условиях, и переносят на среды без фильтратов. Через 1-1,5 месяца культивирования их разрезают в стерильных условиях на фрагменты размером приблизительно 0,3-0,5 см³ и вновь помещают на селективные среды. Так, чередуя селектив­ные и контрольные условия субкультивирования, отбирают каллусы, сохраняющие способность к росту, отдавая предпочтение тем, у ко­торых интенсивность пролиферации выше.

Было установлено, что при многократном пассировании на селек­тивных средах резистентность отобранных устойчивых каллусов сох­раняется. От пассажа к пассажу в селективных условиях увеличива­ется число каллусов, сохраняющих способность к росту [55].

Так, при селекции на резистентность к грибу Ph. cactorum в первом пассаже на среде с 20 % концентрацией культурального фильтрата патогена способность к росту сохраняли 9,68 % каллусов, во вто­ром и четвертом пассажах соответственно-16,67 и 33,33 % (сорт Урожайная ЦГЛ).

При селекции на резистентность к грибу B. cinerea в первом пассаже на среде, содержащей 20 % культурального фильтрата патоге­на, продолжали расти 5,88 % каллусов, а во втором и четвертом 23,33 и 30,00 %, соответственно (Урожайная ЦГЛ).

Обычно через 4-5 пассажей на селективных средах удается отоб­рать каллусные культуры, устойчиво сохраняющие способность к ин­тенсивному росту в присутствии токсинов. Отобранные в ходе ткане­вой селекции каллусы высаживают на среды для регенерации.

5. Индукция морфогенеза из изолированных тканей земляники

Морфогонез из каллусов у земляники идет по типу органогенеза. В каллусах закладываются меристематические клетки, конус нараста­ния, листовые примордии и побеги.

Считается, что каллусы земляники обладают хорошей регенерационной способностью [14]. Однако при проведении работ по тканевой селекции, в силу длительного (12-14 месяцев) их субкультивирования на искусственных питательных средах, регенерация побегов представ­ляет значительные трудности.

Существует большое количество работ, посвященных рассмотрению трудностей морфогенеза [56, 57, 59], причин перехода неоргани­зованно растущих клеток к формированию структур [10, 59]. Опуб­ликован ряд методических рекомендаций и руководств по регенерации растений из каллусов [59, 60], в том числе применительно к земля­нике [15, 16, 61-64].

Наиболее удобна для регенерации земляники питательная среда по прописи Мурасиге и Скуга.

Морфогенез адвентивных побегов из каллусов индуцируют введе­нием в состав питательных сред цитокининов и ауксинов. Как пра­вило, чтобы вызвать морфогенез, повышают концентрацию цитокининов и снижают концентрацию ауксинов в среде. Оптимальное соотношение содержания ауксинов и цитокининов в среде зависит от вида и даже от сорта растения. Считается, что количество добавляемых в среду экзогенных регуляторов роста должно находиться в тесной связи с балансом эндогенных фитогормонов конкретного генотипа [16]. Таким образом, при регенерации адвентивных побегов из каллусов, изучаемые генотипы по-разному реагируют на введение в среду раз­личных концентраций и типов ФАВ. Следовательно, состав сред для разных сортов нужно подбирать индивидуально.

Есть, однако, основания утверждать, что каллусы большинства изучаемых нами сортов (Урожайная ЦГЛ, Фейерверк, Горноуктусская, Куйбышевская, Золушка) достаточно интенсивно регенерируют адвен­тивные побеги на средах, содержащих 5 мг/л 6-БАП и 0,5мг/л ИМК.

У сорта Рубиновый кулон наибольшая интенсивность регенерации адвентивных побегов наблюдалась на средах, содержащих 5 мг/л 6-БАП и 0,2-0,5 мг/л НУК, у сорта Фейерверк на средах с 5 мг/л 6-БАП и 2-0,3 мг/л ИМК.

Есть сведения [16] о возрастании частоты образования адвентивных побегов при увеличении концентрации 6-БАП в среде до 10 мг/л и при сохранении соотношения цитокининов и ауксинов 20 : 1.

Кусочки каллуса размером 0,3-0,5 см³ в стерильных условиях по­мещают на среду для регенерации. Культуральные сосуды переносят в специально оборудованную культуральную комнату, где содержат их при длине светового дня 16 часов и освещенности 2000 люкс. По ме­ре появления придаточных побегов, рекомендуется увеличить интенсивность освещения до 5000-6000 люкс[16], что необходимо для бо­лее активного развития листового аппарата, увеличение синтеза орга­нических веществ и транспирации.

Иногда каллусные культуры на первом этапе содержат в темноте, выставляя на свет (1000-2000 люкс) по мере появления адвентивных побегов, а затем постепенно повышая освещенность до 5000-6000 люкс [14].

В культуральной комнате поддерживают температуру 25±2°С. Для стимуляции образования побегов земляники, согласно мето­дике, опубликованной лабораторией биотехнологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина в 1996 году [14], можно применять шоковые контраст­ные температуры. Для этого пробирки или колбы с каллусами в те­чение 2 часов содержат в термостате при температуре 50±2°С, затем их в течение 24 часов держат в холодильнике при t= 0±2°С и пе­реносят в культуральную комнату с температурой 25±2°С и 16-часо­вым световым днем. Авторы отмечают, что таким путем удается уве­личить коэффициент регенерации адвентивных побегов из каллусов земляники сорта Урожайная ЦГЛ в 2 раза.

При описанных режимах регенерации образование адвентивных по­бегов на каллусах земляники происходит в течение 30-90 дней.