4. Тканевая селекция земляники на устойчивость к фитопатогенным грибам

Наиболее распространенными и вредоносными грибными заболевания­ми земляники ананасной (Fragaria x ananassa Duch.) являются мучнистая роса, вертициллезное увядание, различные фитофторозы, белая пятнистость, бурая пятнистость, серая гниль.

Нами была отработана методика тканевой селекции земляники на резистентность к грибам Phytophthora cactorum(Leb. et Cohn) Shroet и Botritis cinerea Pers. Гриб Ph. cactorum вызывает фитофторозное увядание земляники и фитофторозную гниль ягод.

Фитофторозное увядание начинается с потери тургора периферий­ными листьями куста. Затем поникают и буреют центральные листья. У основания черешков появляются некрозы, растения распластываются по земле и засыхают.

Фитофторозная гниль ягод начинается с появления на них бурых пятен, затем развиваются микроспорангии. Мякоть становится горько­ватой и приобретает резинообразную консистенцию.

В России это заболевание получило широкое распространение [46, 47, 48]. Гибель растений и потеря урожая от Ph. cactorum у восприимчивых сортов может достигать 50-100 %.

Гриб Botritis cinerea Pers. вызывает серую гниль, которая приводит в благоприятных для гриба условиях к потере 50 и более процентов урожая [49, 50, 51]. Он широко распространен, особенно в регионах с большим количеством осадков и умеренным теплом. Это факультативный паразит. Гриб выделяет токсины, убивающие клетки растений, и развивается на мертвых органических остатках. B. cinerea поражает ткани многих видов растений. У земляники серая гниль по­ражает листья, бутоны, цветки, завязи и зрелые ягоды. На поражен­ных плодах сначала появляются бурые пятна, они быстро расширяются и покрывают всю поверхность. Потом появляются конидиеносцы, покры­вающие плоды сплошным серым налетом.

Поскольку как фитофтороз, так и серая гниль обусловлены главным образом действием токсинов на клетки и ткани растений, устойчивость к патогенам определяется устойчивостью клеток к ток­синам. Это позволяет проводить селекцию на резистентность на кле­точном или тканевом уровне [42].

4.1. Приготовление селективных сред

Селективные среды для каллусных культур земляники готовят путем введения культуральных фильтратов патогенов в среды для субкультивирования каллусов. В качестве селективного агента можно использовать также очищенные токсины грибов, но это не всегда целесообразно. Культуральные фильтраты грибов содержат целый комп­лекс веществ, роль которых в патогенезе не является зачастую вполне выясненной. Поэтому по данным ряда авторов, обобщенных в работе Ю.Ю. Глебы и К.М. Сытника [3] предпочтительнее использо­вать для клеточной и тканевой селекции культуральные фильтраты патогенов, а не их токсины.

Нами были использованы культуральные фильтраты грибов Ph. cactorum и B. cinerea, полученные в лаборатории имму­нитета ВНИИГиСПР Л.А.Ищенко и И.Н.Чесноковой.

Оптимальные концентрации селективного агента следует подби­рать индивидуально. Они не должны вызывать стопроцентной гибели каллусных культур, но должны подавлять рост большинства каллусов.

Чтобы осуществить подбор оптимальных концентраций селективного агента, мы рекомендуем готовить среды для субкультивирования каллусов с содержанием культурального фильтрата патогена 0 (кон­троль), 5, 10, 15, 20, 25 и 30%. На приготовленные среды нужно высадить каллусы земляники и культивировать их в течение месяца в условиях, описанных в разделе 3.

Через месяц рост каллусов оценивают по шестибалльной шкале, где 0 - отсутствие роста, а 5 баллов - увеличение объема каллуса в 5 и более раз.

Следует иметь в виду, что при градуальном возрастании концен­трации селективного агента в среде в ряде случаев снижение интен­сивности роста каллусов происходит не монотонно. При небольших концентрациях (10 % фильтрата) может происходить, вопреки ожиданиям, некоторое увеличение интенсивности пролиферации каллуса. Причины этого явления достаточно подробно описаны в литературе [52, 53, 54]. На практике же следует учитывать, что у сортов зем­ляники, различающихся по устойчивости к патогену, концентрации культурального фильтрата, при которых будет наблюдаться некоторая стимуляция пролиферации каллусных культур, и концентрации, при которых будет достигаться устойчивое снижение интенсивности роста каллусов, будут различными. (Этот факт может быть использован для предварительного тестирования на устойчивость).

Поэтому при подборе концентраций селективного агента в среде для тканевой селекции необходимо брать ряд постепенно нарастающих концентраций и каллусы сортов земляники заведомо различающихся по устойчивости к патогену. Для работы следует выбирать концентрацию культурального фильтрата в среде, при которой у среднеустойчивых к патогену сортов сохраняют способность к росту 5-15 % каллусов.

Для культурального фильтрата гриба Ph. cactorum эта концентрация равна 20 %, для гриба B. cinerea 15-20 %.

Необходима проверка грибных токсинов на термостабильность. Если они окажутся неустойчивыми к высоким температурам, следует применять холодную стерилизацию культуральных фильтратов путем пропускания их через мембранные фильтры с последующим добавлением в ламинар-боксе в разогретую среду.

Опытами, проведенными в лаборатории биотехнологии ВНИИГиСПР, доказана достаточно высокая термостабильность токсинов Ph. cactorum и B. cinerea. Это позволяет вносить их в питательные среды до автоклавирования, что значительно проще технически.