3.Выбор исходного экспланта, индукция и культивирование каллусов

Для получения культуры каллусов земляники исходный эксплант высаживают на среду каллусообразования.

По определению Х.М. Чайлахяна с соавторами [45] исходным эксплантом является фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса. У зем­ляники в качестве первичного экспланта могут быть взяты фрагменты листьев, корней или побегов.

Как показывает опыт проведения тканевой селекции земляники в лаборатории биотехнологии ВНИИГиСПР им. И.В. Мичурина, существен­ных различий, между каллусами разного происхождения не наблюдает­ся. Поэтому мы рекомендуем в качестве исходных эксплантов исполь­зовать листья, как наиболее удобный объект. Предпочтение следует отдавать молодым листьям.

Листья можно брать с растений, произрастающих в грунте, или с растений, культивируемых на искусственной питательной среде.

При введении в культуру листовых эксплантов с растений, нахо­дящихся в грунте, необходима стерилизация. Сначала листья промы­вают в проточной воде, затем стерилизуют. В качестве стерилизую­щих растворов можно использовать 5-9 % (50-90 г/л) гипохлорит натрия или каль­ция, 10 %(100 г/л) перекись водорода, 0,1 % (1 г/л) диацид или 0,1 % (1 г/л) сулему.

Наилучшая стерилизация, на наш взгляд, достигается при исполь­зовании раствора сулемы, в который нужно поместить листья на 45-180 секунд, в зависимости от их возраста и размера. Для стерилизации молодых и слабо опушенных лмстьев время стерилизации не должно превышать 45-60 секунд. Листья сортов с сильным опушением следует стерилизовать не менее 90-120 секунд. Затем следует триж­ды промыть их дистиллированной водой.

После описанной обработки, манипулируя пинцетом и скальпелем (или ножницами) листья в ламинар-боксе разрезают на сегменты 0,5-I см² и помещают горизонтально на агаризованную питательную среду.

В литературе нет единого мнения по поводу того, какой сторо­ной лучше помещать листья на питательную среду [14, 15]. В наших опытах помещение листовых эксплантов земляники верхним эпидерми­сом к поверхности среды оказалось более эффективным для каллусогенеза.

Можно исключить процесс стерилизации, используя для взятия ли­стовых эксплантов растения, культивируемые на искусственных сре­дах. Методика получения таких растений достаточно подробно описа­на и сравнительно проста [15].

Небольшие листовые пластинки с растений, культивируемых in vitro, можно помещать на искусственную питательную среду целиком. Однако, чтобы ускорить каллусогенез лучше все же сделать срезы по краям. Именно на этих срезах и на срезе черешка начнет образовы­ваться каллус.

У всех изучавшихся сортов земляники индукция каллусов успешно происходит на среде Мурасиге и Скуга в присутствии ауксинов. Одна­ко, у земляники в связи с различиями в гормональном составе сред наблюдаются сортовые различия в интенсивности каллусообразования.

Так сорт Фейерверк интенсивно образовывал каллусы в присутст­вии 2-5 мг/л ИМК. У сортов Рубиновый кулон и Урожайная ЦГЛ наибольшая интенсивность каллусообразования наблюдалась в присутствии 2-5 мг/л НУК. Однако, каллусы, образовавшиеся в присутствии НУК, быстро тем­нели вследствие выделения фенолов и снижали способность к регене­рации. Чтобы избежать этого, можно добавить в среду глутатион вос­становленный в концентрации 100 мкМ или аскорбиновую кислоту (750 мкМ). Однако, если каллусные культуры предназначены для дальнейше­го использования в тканевой селекции на устойчивость к стрессорам, применение антиоксидантов нежелательно, т.к. искажает картину дей­ствия селективного агента.

Применение ИУК, даже в оптимальных концентрациях (1-2 мг/л) приводило к образованию каллусов лишь у 5,5- 8,67 % эксплантов.

Наиболее универсальным веществом из группы ауксинов для всех изучаемых сортов оказалась 2,4-Д в концентрациях 2-4 мг/л. Образо­вание и рост каллусов в ее присутствии шли на первых этапах значи­тельно медленнее, чем на средах с НУК. Однако каллусы не темнели и сохраняли способность к регенерации после длительного субкульти­вирования.

Было отмечено также, что 2,4-Д значительно увеличивает частоту сомаклональных изменений, что делает данный ауксин особенно ценным для тканевой селекции.

Для индукции первичного каллуса экспланты земляники после вы­садки на среду помещают в темноту и инкубируют при t = 25± 2°С. Обычно, к концу четвертой недели экспланты образуют каллусы (у сор­та Горноуктусская через 1,5 месяца). Для поддержания и размножения через каждые 35-40 дней их нужно пересаживать на свежие среды, для чего в ламинар-боксе стерильным скальпелем делят исходный каллус на кусочки размером около 0,3 см³ и переносят в культуральные сосуды со свежей средой. Ус­ловия выращивания аналогичны условиям, при которых происходило инициирование каллусных культур.

Примерно через 2,5-3 месяца общая масса каллусных культур ста­новится достаточной для начала работ по тканевой селекции.