36. Методы прямого переноса генов.

Метод инъекций ДНК в клетки и растения – этот метод позволяет вводить чужеродный генетический материал непосредственно в клетки без помощи агробактерии. Метод заключается в том, что на определенной стадии развития растения шприцом в ткань вводится чужеродный генетический материал, образующиеся затем семена анализируют по селектируемому признаку.

Разновидность метода инъекций в клетки и растения является метод микроинъекций клеток. Разработан для животных. Для микроинъекции клеток растений требуется специальное оборудование. Этот метод универсален, так как в качестве реципиента могут быть использованы как единичные культивируемые клетки, так и клетки пыльцы, эмбриоидов и соматических тканей.

Метод электропорации (электрошока) клеток впервые был разработан для клеток животных и заключается в том, что через смесь протопластов и векторной ДНК пропускают короткие импульсы тока высокого напряжения. В момент прохождения тока в мембране протопластов образуются отверстия (поры), через которые молекулы ДНК успевают проникнуть внутрь клеток. Для целых клеток этот метод не эффективен, поскольку оболочки растительных клеток очень толстые.

В ряде случаев с целью защиты генетического материала от разрушения нуклеазами используется метод упаковки ДНК в липосомы.

Липосомы – это сферические образования, оболочки которых состоят из фосфолипидов. С помощью липосом в протопласты растений были введены РНК вируса табачной мозаики, ДНК Ti-плазмиды и даже целые метафазныс хромосомы.

В настоящее время разработан совершенно новый метод генетической трансформации, получивший название биологической баллистики или метод обстрела тканей микрочастицами (бомбардировки). Это самый эффективный метод трансформации, который может использоваться для любых тканей и различных растений, способных к регенерации. Он особенно ценен тем, что позволяет осуществлять трансформацию однодольных растений.

Принципиальная схема работы таких установок заключается в следующем. Сначала готовится ДНК для переноса и микроноситель. ДНК осаждается на микрочастицы вольфрама или золота размером от 0,6 до 1,6 мкм в зависимости от типа обстреливаемой ткани. Для лучшего осаждения ДНК на микрочастицах используют специальные добавки, например, спирмидин. Затем приготовленные частицы накапывают на целлофановые подложки, высушивают и помещают в канал пушки. Одновременно готовят материал (каллус, суспензия клеток, листовые диски и т. п.), в который будет переноситься чужеродная ДНК. Стерильные клетки или ткани помещают в чашки Петри и тоже вставляют в камеру пушки для обстрела. Из камеры отсасывают воздух, снижая давление до 0,1 атм. Затем осуществляют выстрел, в результате которого микрочастицы с нанесенной ДНК разгоняются и проникают в клетки. Во время прохождения микрочастиц через клетки ДНК отделяется и может застревать в цитоплазме и ядре. Попавшая в ядро плазмидная ДНК сохраняет биологическую активность, и взаимодействует с ДНК растительной клетки. В таких клетках и осуществляется генетическая трансформация. Обстрелянные ткани и клетки переносят на селективную среду, на которой происходят отбор и регенерация трансформантов.

Эффективность трансформации этим методом довольно высокая, а главное, она применима для любых типов тканей и видов растений. С ее помощью получены трансгенные растения пшеницы, кукурузы, ячменя и др.