28. Методы контроля вирусной инфекции в процессе оздоровления и размножения семенного материала картофеля (метод иммуноферментного анализа, метод электронной микроскопии).

ИФА проводится с использованием полистироловых пластин с 96 лунками, т. е. одновременно можно протестировать 16 растений на 6 вирусов.

Методика выполнения анализа следующая: 1) на первом этапе в оптически прозрачные полистироловые платы вносят антитела, полученные из крови кролика при введении в его организм препарата вируса. Антитела адсорбируются на поверхности за счет электростатических взаимодействий и остаются в виде пленки в лунках полистироловых плат; таким образом, повышается чувствительность плат к наличию вирусной инфекции; 2) на втором этапе в лунки вносят тестируемые образцы (сок листьев, ростков, клубней). Если материал зараженный, вирусы связываются с фиксированными на первом этапе антителами; 3) на третьем этапе в лунки вносят меченные ферментом антитела к определенному вирусу (их называют коньюгат), которые специфически связываются с вирусами на антителах, фиксированных на полистироле.

Если в тестируемом материале есть вирус, то в конечном итоге получается комплекс, состоящий из антитела-вируса-антитела-фермента, причем произойдет ферментная реакция, вследствие чего развивается ярко выраженное изменение окраски (коричневая).

Наличие или отсутствие вируса может быть определено визуально или спектрофотометрически, с помощью фотометра, т. е пропуская пучок света через каждую лунку полистироловой платы.

При визуальной оценке интенсивность окраски в лунках с анализируемыми пробами сравнивают с интенсивностью окраски в лунках с контролем (в качестве контроля используют сок заведомо здоровых растений). При использовании фотометров, т. е. пропуская пучок света через каждую лунку платы происходит разбивка цветовой шкалы в диапазоне цветов, от отрицательного, до положительного контроля.

При этом результаты анализа можно фиксировать условными обозначениями: «-» – вирус отсутствует, «+» – материал заражен.

Метод электронной микроскопии. Разрешающая способность электронного микроскопа – 40–60 тысяч раз, что позволяет увидеть в поле зрения вирусную частицу. С помощью этого метода можно определить относительную концентрацию вирусных частиц в соке или препарате и подсчитать их количество на единице площади листа или в единице массы исследуемой ткани. Достоинство электронной микроскопии как метода диагностики вирусов состоит в возможности использования небольшого количества сока или растительной ткани. Высокая чувствительность метода позволяет обнаруживать вирусы, находящиеся в растениях в низкой концентрации. Недостаток метода – необходимость дорогостоящего и сложного оборудования.

29. Получение микроклубней картофеля in vitro и их использование в элитном семеноводстве.

Пробирочные растения картофеля могут использоваться для получения мини- или микроклубней. Для получения миниклубней пробирочные растения высаживаются в защитный грунт. Обязательно использование защитного грунта, так как пробирочные растения имеют слабую корневую систему, привычную к доступности питательных веществ, поэтому для высадки тщательно готовится субстрат, лучше использовать верховой торф; у растений, полученных in vitro, уменьшается или отсутствует полностью кутикулярный восковой налет на листьях и недостаточно эффективно работает механизм открывания – закрывания устьиц, так как в пробирке транспирация протекает наиболее интенсивно. Все это требует обязательного высаживания пробирочных растений в условия защитного грунта для снижения стресса при переносе растений из условий in vitro в условия ex vitro.

Микроклубни картофеля имеют диаметр 0,5–1,5 см (крупная горошина до размена вишни). Если растение картофеля, растущее в пробирке на питательной среде, подвергнуть действию стрессового фактора, то через 1,5–2 месяца на нем образуются микроклубни. Сокращение фотопериода, снижение температуры культивирования до +10-12 °С и освещенности до 50–100 люкс или помещение пробирочных растений в условия полной темноты, увеличение в составе питательной среды концентрации углеводов 40– 60 г/л, добавление в питательную среду регуляторов роста – цитокининов, абсцизовой кислоты, хлорхолинхлорида, – все это индуцирует клубнеобразование картофеля в условиях in vitro. Одно пробирочное растение картофеля способно сформировать 1–2 клубня. Способ получения микроклубней. Черенок картофеля сажают на питательную среду, содержащую индукторы клубнеобразования и помещают в обычные условия культивирования – это 16 часовой фотопериод, температура +20–24 °С градуса, освещенность 6000 лк.). В течение 15-20 дней происходит развитие растения с 5–6 листочками и уже это растение помещают в стрессовые физические условия. Весь период клубнеобразования протекает в среднем 2 месяца. Образовавшиеся в условиях in vitro клубни можно хранить в закрытой стеклянной таре при температуре +4–5 °С.