Biotekh_zadachi_MMA_Word_1
.doc|
Задача 1 В процессе промышленного производства аскорбиновой кислоты используется многостадийный химический синтез,… Это многостадийный химический процесс, в котором первая стадия биотехнологическая трансформация d-сорбита в l-сорбит при участии ацетатных бактерий. Культуру продуцента Gluconobacter oxydans выращивают в ферментерах периодического режима с мешалкой для усиления аэрации и массообмена в течение 20-40 ч с расчетом по выходу сорбозы до 98% от исходного количества сорбита. Для увеличения выхода в питательную среду вносят 20% кукурузного или дрожжевого экстракта. Также при переходе от периодического культивирования продуцента к непериодическому увеличивается скорость образования сорбозы в 1,7 раз.
|
Задача 2 Довольно часто при получении лекарственных средств биотехнологическими методами,… Условия проведения биотрансформации: рост каллуса - свет - температура 24-26 - влажность 60 – 70% - уменьшенная аэрация – биореакторы 20м3 с системами перемешивания (турбинное, встряхивание) - жидкие питательные среды (микро-, макроэлементы, витамины, цитокинины, фитогормоны, глюкоза) Недифференцированные культуры клеток D.lanata не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакцию биотрансформации субстратов, добавляемых в питательную среду. Растения D.lanata в большом количестве синтезируют дигитоксин вместо необходимого дигоксина. Для соответствующей биотрансформации используют недифференцированную суспензионную культуру. Иммобилизованные клетки могут трансформировать метилдигитоксин метилдигоксин. Иммобилизация каллусной культуры D.lanata в полиуретан. Носитель с клетками помещают в питптельную среду, клетки живые. Они прекращают рост, но продолжают синтез метаболитов. Преимущества иммобилизованных клеток: многократное использование, получение большого количества вторичных метаболитов, уменьшение времени ферментации, увеличение срока работы клеток.
|
Задача 3 При получении генно-инженерного инсулина, основанного на раздельном биосинтезе 2 цепей,… Продуцент – E.coli На основе плазмид конструируются векторы (для 2-х цепей). К каждой последовательности присоединяют триплет, соответствующий метионину и нуклеотидам гена бетагалактозидазы (+оперон). Ферментация 2х культур с вектором, несущим цепь А, и вектором, несущим цепь Б, проводилась на среде с лактозой (индуктор синтеза бетагалактозидазы). Т.к. бетагалактозидаза и цепь А (или Б) имели в векторе общий промотор, то накопление бетагалактозидазы сопровождается накоплением цепи А (Б). по окончании ферментации выделялись два белка: цепь А + бетагалактозидаза и цепь Б + бетагалактозидаза. Метиониновый остаток, связывающий инсулиновую цепь с бетагалактозидазой разрушается с помощью BrCN, а инсулиновые цепи при этом освобождаются. Затем цепи А и Б объединяются в молекулу инсулина. Токсичность рекомбинантного инсулина: из-за микробных липо- и гликопротеинов. Необходимо особо тщательное выделение и очистка.
|
|
Задача 4 В настоящее время существует международная программа системы поиска и отбора антимикробных агентов,… Геном патогенной бактерии (S.typhi) с помощью большого набора рестриктаз делится на сотни фрагментов (х). каждый фрагмент соединяется с лишенным промотора геном хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. Такой ген не может реплицироваться при введении в клетку. Но он мог бы реплицироваться если соединенный с ним ген (фрагмент ДНК сальмонеллы) имел бы промотор для своей репликации. К этому сдвоенному фрагменту присоединяют также лишенный промотора лактозный оперон, который нужен для системы окисления лактозы. Далее этот тройной фрагмент включается в плазмиду. Т.к. фрагменты различаются по части, происходящей из генома сальмонеллы (она содержит разные участки генома), то получаем набор плазмид, а после включения в клетку E.coli набор разных штаммов E.coli. Далее внедряем каждый штамм E.coli в организм мыши и вводим хлорамфеникол. Спустя сутки из ткани животного высеивают бактериальную культуру )на твердой питательной среде с лактозой). Выросшие культуры могут быть красного или белого цвета. Отбираем колонии белого цвета. Если мз животного, которому ввели хлорамфеникол, выселилась жизнеспособная клетка, значит в ней экспрессировался ген хлорамфеникол-ацетилтрансфераза и орразовался фермент, инактивирующий антибиотик. Следовательно, в данном фрагменте есть ген с промотором. Но могли экспрессироваться как ivi-гены (гены вирулентности), так и kiping-гены (они экспрессируются в любых условиях). В колониях красного цвета экспрессировался ген, кодирующий образование фермента, расщепляющего лактозу ( изменение цвета), т.е. в данном фрагменте содержится hkg, т.е. он экспрессируется всегда. Если колония бесцветная, значит на питательной среде промотор не работал и ген во фрагментах не экспрессировался. Следовательно, он нужен только для развития инфекционного процесса и относится к ivi-генам.
|
Задача 5 При получении штаммов суперпродуцентов аминокислот, например треонина или лизина… Преимущества биосинтеза перед оргсинтезом: оргсинтез более дорогой, требующий высокую t, дорогостоящие катализаторы; образование побочных продуктов, загрязнение окружающей среды. Кроме того, при биосинтезе продукт – L-аминокислоты, а при оргсинтезе – смесь D и L, которую разделить довольно сложно. Штамм-суперпродуцент лизина – Corynebacterium glutaminicum; треонина - Е.coli Путь биосинтеза лизина: Схема Треонин и лизин, находясь в избытке одновременно подавляют аспартокиназу. Но в среду можно добавить треонин и метионин в ограниченном количестве: штамм растет пока их не израсходует. После исчерпания треонина начнется синтез лизина (2х стадийный процесс) Механизмы разделения биосинтеза:
У штамма-суперпродуцента системы регуляции нарушены Условия ферментации: - ферментер - питательная среда: оптимальная с источников углерода, аммонийного азота, минеральных солей, факторов роста - оптимуи рН и t - аэробные условия, перемешивание
|
Задача 6 Одно из существенных мест на фармацевтическом рынке занимают стероидные гормоны,... Кортикостероиды, прогестогены, эстрогены, андрогены содержат кетогруппу в С3, у эстрогенов кольцо А – ароматическое. Кортикостероиды содержат в С17 гидроксизамещенную ацетильную группу, а у С11 – кислородную группу. Андрогены и эстрогены: С17 - =О или –ОН. Стерины: С3 –ОН Сырье: фито- или зоостерины содержат циклический скелет – циклопентанпергидрофенантрен.
Сырье микроорганизм продукт химический синтез ЛП Биотрансформация позволяет провести уникальные реакции, невозможные для химического синтеза. Absiolia, Beanveria – 11-α-гидроксиметилирование Corynebacterium – изомеризация.
|
|
Задача 7 Как известно, производство витамина В12 (кобаламина) осуществляется чисто биотехнологическим способом… Культвируют продуценты В12 на средах, приготовляемых из пищевого сырья (кукурузный и мясной экстракты, соевая и рыбная мука). Выращивают периодическим методом в анаэробных условиях на среде содержащей соли Со и (NH4)2 SO4 . в процессе ферментации образуются кислоты, которые нейтрализуют, подавая в ферментер раствор щелочи. Через 72 часа после начала ферментации в питательную среду вносят предшественник (5,6-ДМБ – диметилбензимидазол), т.к. без добавления него вместо витамина В12 синтезируется кобанамид, который не обладает терапевтическим действием. Псевдовитамин В12, у которогоазотистое основание – аденин. Время фементации – 6 часов. В12 остается в клетках бактерий, т.е. в биомассе, которую сепарируют, а целевой продукт экстрагируют подкисленной водой. Для предотвращения образования коферментной формы витамина В12 в качестве стабилизатора добавляют NaNO2.
|
Задача 8 Иммунобиотехнология, как наука и производство с одной стороны,… Активное воздействие: вакцины на основе рекомбинантных протективных АГ, живые гибридные носители Пассивное воздействие: а) специфическое: поликлональные АТ – на инфекционных агентов, микробных токсинов б) неспецифическое: рекомбинантные интерлейкины, интерфероны и другие цитокины. Для облегчения доставки ЛВ к месту действия использубт:
Применение моноклональных АТ:
|
Задача 9 Применение иммобилизованных ферментов и белков в медицине открывает новые возможности создания эффективных лекарственных средств. Гидролазы – ферменты, обеспечивающие гидролитическое расщепление связей (с участием воды). К гидролазам относится фермент микроорганизмов – β-лактамаза, который расщепляет β-лактамное кольцо, обеспечивая антибиотикорезистентность: схемы |
|
Задача 10 Одна из инфекционных клиник закупила партиии пенициллина и стрептомицина. Механизмы антибиотикорезистентности: 1.Изменение конформации внутриклеточной мишени для данного а/б. 2.Уменьшение проницаемости оболочки микробной клетки для а/б. 3.Появление в оболочки клетки системы активного «выброса» проникающего в клетку а/б. 4.Ферментативная инактивация а/б защитными ферментами. Формирование в бактериальной клетке этих механизмов связано с появлением «генов резистентности» В хромосомах и R-плазмидах, которые могут передаваться из клетки в клетку коньюгацией (без деления клетки). В результате возникает «инфекционная резистентность» к а/б разных групп и как следствие «госпитальная нфекция». Механизмы индукции в-лактамаз (PBPs-2 и 3): PBPs — мишень для связывания с а/б. а/б реагирует с данным из белков, прин к PBPs —> изменение конформации этого белка —> изменение биофигурации параметров белка —> сигнал передается на специальный трансмембранный белок, молекула которой пересекает цитоплазматическую мембрану и выходит на её внешнюю поверхность —> сигнал передается на белок-репрессор, регулирующий экспрессию гена в-лактамазы — репрессор перестает подавлять экспрессию гена —> синтез иРНК —> иРНК поступает в рибосомную систему, где синтезируются молекулы в-лактамазы. Решение проблемы: -перерыв в использовании старых а/б: уменьшается количество генов резитентности и тогда а/б вводят снова. -синтез новых а/б. - поиск ингибиторов в-лактамаз: клавулановая кислота. Их использование вместе с а/б.
|
Задача 11 Определите оптимальные параметры ведения процесса биосинтеза противоопухолевых а/б. 1.Продолжительность лаг-фазы 11(24), в этот период не наблюдается роста биомассы, но есть увеличение количества белков. 2.Прирост биомассы мах на 59 часы роста, фаза роста (трофофаза продолжается до 59 ч. роста и характеризуется: pH=6.5,N2=81/2,PO2=52, углеводы=5.36.) 3.Начало синтеза а/б совпадает с уменьшением количества углеводов. 4.Биомасса на 40-60 ч., уменьшение прироста совпадает с уменьшением количества углеводов,N2,PO2. 5.мах скорость биосинтеза совпадет мах биомассой Оптимальные условия процесса. 1.т.к. При увелеичении роста биомассы уменьшается количество углеводов, PO2,N2, то необходимо в процессе биосинтеза добавлять их. 2.мах удельная активность 277-145=102, при этом pH=6, углеводы=6,22, глюкоза=86,8, pO2=60, т.е. необходимо поддерживать показатели на этом уровне. 3.По окончании процесса pH и N2 мах, а углеводы, глюкоза и PO2 min. 4.Продление процесса: заменить глюкозу на крахмал (медленно утилизирующийся п/сах.
|
Задача 12 Определите оптимальные параметры ведения процесса биосинтеза противоопухолевых а/б. 1.Продолжение лаг-фазы 11(11-20)ч., в этот период не наблюдается роста биомассы. 2.Прирост биомассы мах на 35-11ч. Роста, фаза роста (трофофаза) продолжается до 35ч. от начала процесса и характеризуется:pH=6,7, N2=81,2,PO2=2ч.,углеводы =4. 3.Начало синтеза а/б совпадает с уменьшением роста биомассы.
Оптимальные условия процесса. 1.т.к. При увелеичении роста биомассы уменьшается количество углеводов, PO2,N2, то необходимо в процессе биосинтеза добавлять их. 2.мах удельная активность 277-145=102, при этом pH=6, углеводы=6,22, глюкоза=86,8, pO2=60, т.е. необходимо поддерживать показатели на этом уровне. 3.По окончании процесса pH и N2 мах, а углеводы, глюкоза и PO2 min. 4.Продление процесса: заменить глюкозу на крахмал (медленно утилизирующийся п/сах.).
|
|
Задача 13 Биотехнология как наука и производства основана на использовании определенных агентов... Биотехнология — направление научно-технического прогресса, использующее биологические процессы и агенты для целенаправленного воздействия на природу, а также в интересах промышленного получения полезных для человека продуктов, в частности ЛС. Характерно тесное переплетение биотехнологии и биоорганической химии, а также с молекулярной биологией и генетикой (создание рекомб. м/орг, моноклональных АТ и др.).Также биотехнология способна использовать в производстве неприродные биообъекты. Сырьё,энергитические ресурсы, труд.+ биообъект, процессы и аппараты —> биосинтез —> потребление продукции, выделение и очистка БАВ, отходы производства —> ЛС Дрожжи —> сквален —> эргостерин —> вит Д2 Digitalis Lanata — дигитоксин (суспен. Культура)
|
Задача 14 Существуют вполне определенные требования и условия, необходимые для создания и развития биотехнологического производства ЛС. Биообъект — это продуцент,биосинтезирующий нужный продукт,либо катализатор, фермент,который катализирует присущую ему рекцию.М.б.цельносохранивший жизнеспособность многоклеточный или одноклеточный организм, изолированные клетки, вирусы, ферменты. Функция биобъекта — полный биосинтез целевого продукта, включ. ряд ферментных реакций или катализ 1 ферм. Реакции,которое имеет ключевое значение для получения продукта.Продуцент — биообъект, осущ.полный биосинтез целевого продукта. Биообъект, выделенный из природной среды, необходимо совершенствовать. Для увелечения продуктивности, исп-ия дешевых питательных сред, измемнения метаболизма биообъекта, получения фагоустойчивых биообъектов и др. Механизмы преобразования: 1.Мутагенез и селекция:дупликация, делекция, транспозиция, инверсия и др. 2.Клеточная инженерия — обмен участками хромосом и про-и эукариот. 3.Генная инженерия — производство гормонов, интерферонов
|
Задача 15 Как известно, при использовании клеточной инженерии в создании продуцентов широко применяется методика протопластирования. Для обмена фрагментами хромосом у прокариот необходимо получить лишенные клеточной стенки протопласты —> осущ.слияния протопластов с образованием диплоидов —> инкубировать их —> высевание на твердую питательную среду —> диплоиды превращаются в гаплоиды —> способность к размножению клетки, кот.образует колонии. Получение протопласта 6 удаление у микроорганизма клеточной стенки с помощью ферментов(лизоцим — из белка куриного яйца). Но происходит лизис мембран из-за разницы осмотического давления. Следовательно, удаление клеточной стенки производят в гипертонической среде с 20% раствором сахарозы или 10% растворе NACL. Далее объединяют суспензии 2-х образцов протопластов с добавлением полиэтиленгликоля —> протопласты с 2 наборам хромосомного материала. Получают: гибридные в-лактамы, эритромицины+антрациклины (агликон эритромицина+сахара антрациклина) и т.д.
|
|
Задача 16 В современной биотехнологии при создании ЛС особое место отводят генной инженерии.... Вектор-часть рекомбинантной ДНК, обеспечивающее её проникновение в клетку и репликацию в этой клетке. Вектор конструируются на основе плазмид, фагов. Для проникновения вектора в клетку, её обрабатывают солями лития или кальция — возникают отверстия небольшого диаметра в стенке оболочки клетки. 1.Встраивание ДНК в вектор —> с помощью ректриктаз, которые разрушают 1 нить ДНК —> расхождение нитей —> включение гена в цепи (фермент-лигаза)ю 2.Высевание суспензии клеток микроорганизма на питательную среду —> проверка культур на содержание вектора с геном, кодирующим целевой продукт. In vitro или на животных с помощью гена-маркера. У прокариот: участок ДНК —>иРНК —> последовательность аминокислот. У эукариот: участок ДНК —> и.РНК: сод.интроны и экзоны —> вырезка интронов(сплайсинг) —> иРНК —> последовательность аминокислот.
|
Задача 17 Появление таких новых дисциплин как геномика и протеомика является настоящим прорывом в биологии..... Геномика:
Генотерапия: выявление связи генетических вариаций и мутаций с заболеваниями. -моногенные заболевания: дефект 1 белка -полигенные заболевания: дефект нескольких белков Возможно введение недостающих генов в организм. Антисмысловые олигонуклеотиды. Заболевания может быть связаны с гиперпродукцией белка-> необходимо подавить экспрессию гена, кодирующий этот белок. Антисмысловые олигонуклеотиды — получение комплементарной для ДНК каждого гена последовательности нуклеотидов, которые будут реагировать с ДНК гена. Подавление образования белка будет происходить на стадии транскрипции.
|
Задача 18 Современный скрининг ЛС предполагает получение новых ЛС, более эффективных и безопасных. 1.Секвенирование огромного количества нуклеотидов (определение последовательности). 2.Таргетный скрининг — поиск внутриклеточной мишени для антимикробного агента. Далее выевляется ген, кодирующий образование этой мишени.В современном мире позволяет в соответствии с выбором гена отбирать БАВ с запланированным механизмом действия.1 этап: выделение гена из генома.2 этап: с помощью ПЦР фрагмент ДНК . Затем конструируется: бесклеточная система получения иРНК; бесклеточная система, где иРНК служит для наработки белка. Далее устанавливают функцию и свойства белка. 3.Поиск ivi генов — см.№4
|
|
Задача 19 Резистентность сегодня является настолько серьезной проблемой лекарственной терапии, что грозит вернуть человечество….. Механизмы резистентности: 1. изменение конформации внутриклеточной мишени для данного антибиотика 2. снижение проницаемости оболочки микробной клетки для антибиотика 3. появление в оболочке клетки системы активного «выброса» проникающего в клетку антибиотика 4. ферментативная инактивация антибиотика защитными ферментами Формирование защитных механизмов связано с появлением «генов резистентности» в хромосомах и R-плазмидах (кольцевые ДНК). Плазмиды могут передаваться из клетки в клетку конъюгацией (без деления клетки). Возникает резистентность у большого числа клеток – «информационная резистентность». Причиной антибиотикорезистентности являются спонтанные мутации в структурном гене, определяющем структуру мишени. Такие мутировавшие гены могут оказаться в плазмидах и передаваться в другие клетки, но переноса резистентности может и не быть. В плазмиде могут локализовываться несколько генов, кодирующих ферменты, воздействующие на антибиотики разных групп, появляются полирезистентные штаммы. Преодоление резистентности: 1. перерыв в использовании старых антибиотиков 2. производство новых антибиотиков 3. ингибирование механизмов резистентности Гены бета-лактамаз могут находится как в хромосомах, так и в плазмидах (много копий в одной клетке). R-плазмиды могут передаваться при конъюгации в одной или разной популяции. Конъюгативные транспозоны – сегменты ДНК, которые могут перемещаться между репликонами, имеющие структурные гены и обеспечивающие устойчивость к антибиотикам. Они могут встраиваться в хромосомы и вызывать антибитикорезистентность.
|
Задача 20 Как известно, под названием «антибиотики» объединены вещества, образуемые одними микроорганизмами для подавления роста других…. Антибиотики – вещества, образуемые микроорганизмами и избирательно подавляющие рост других микроорганизмов. Характерная черта – избирательное действие на метаболизм, подавление первой из тысяч метаболических реакций. В этом их отличие от антисептиков. Антибиотики используют для подавления роста одного или нескольких видов микроорганизмов. Классификация антибиотиков: 1. по биологическому происхождению:
2. по технологии получения:
3. по терапевтическому эффекту
|
Задача 21 Важнейшая группа антибиотиков, образуемых плесневелыми грибами – пенициллины и цефалоспорины, объединенные под общим названием беталактамных антибиотиков, достаточно широко представлены на фармацевтическом рынке. Бета-лактамы
Продуценты: Penicillium, Cephalosporium Биологическая активность – широкий спектр Биологическая роль антибиотиков для продуцентов. Механизмы защиты: Это средство для преодоления «стрессовых» ситуаций для продуцента: исчерпание питательных веществ в результате роста микроба-конкурента. Механизмы биосинтеза антибиотиков: Первичные метаболиты -> мультиферментный комплекс -> молекула антибиотика -> «экспансия» с помощью фермента «экспандаза». Механизмы действия на бактериальную клетку: 1. ингибиторы образования клеточной стенки бактерий ( бета-лактамы подавляют замыкание пептидных цепочек в мостики -> не происходит образование пептидогликана) 2. ингибиторы белкового синтеза (нарушение синтеза белка в рибосомных системах) – аминогликозиды, тетрациклины 3. ингибирование синтеза нуклеиновых кислот - противоопухолевые 4. ингибирование функции цитоплазматической мембраны клеток (поры в мембране) – нистатин.
|
|
Задача 22 Актиномицеты являются продуцентами огромного количества антибиотиков. Актиномицеты: 1. схожи с бактериями: прокариоты; геном – это кольцевая хромосома, не отделенная мембраной; не содержит митохондрий; клеточная стенка – пептидогликан. 2. схожи с грибами: многоклеточные организмы со сложным циклом развития; образуют споры. Состав молекулы аминогликозидов: 1. шестичленный аминоциклитол 2. остатки сахаров Биологическая активность: Широкий спектр: пневмония, чума, туляремия, бруцеллез, эндокардит, инфекции мочеполовых путей, перитонит, менингит и т.п. Механизм действия – ингибиторы белкового синтеза Связывание с рибосомами -> нарушение синтеза белка Митохондрии животной клетки защищены мембраной -> малая токсичность для человека. Бактерицидное действие: связываются с малой субъединицей рибосом в месте, где происходит узнавание иРНК антикодонами тРНК -> нарушение точности узнавания -> белковые олекулы с неверной последовательностью аминокислот -> они включаются в цитоплазматическую мембрану -> клетка теряет метаболиты, коферменты, ионы -> дисбаланс -> гибель
|
Задача 23 Весьма существенную роль для продвижения антибиотиков в производственную сферу играет возможность проведения сравнительной идентификации антибиотика на начальных этапах….. Методы идентификации: 1. химические реакции 2. ГЖХ, ВЭЖХ и т.п. Определение активности: 1. микробиологический метод диффузии в агар с тест-культурой микроорганизмов в сравнении со стандартными образцами препаратов 2. способы выделения антибиотиков из культуральной жидкости:
3. получение индивидуального вещества:
4. количественная оценка:
|
Задача 24 Биотехнологическое производство в фармацевтической промышленности – это система устройств периодического или непрерывного действия. 1. Исходное сырье + энергетические ресурсы + труд 2. биообъект + процессы и аппараты 1 + 2 биосинтез (ферментация) 3. побочные продукты 4. выделение и очистка БАВ KC 5. отходы проихводства Классификация: 1. по принципу организации материальных потоков:
2. по характеру культивируемого продуцента:
3. по типу целевого продукта:
|
|
Задача 25 Биосинтез ЛС и БАВ в условиях производства требует создание стерильных условий при многостадийности всего процесса в целом. Многокомпонентность синтеза: 1. сырье, энергетические ресурсы, труд 2. биообъект, процессы, аппараты 1 + 2 биосинтез побочные продукты выделение и очистка БАВ ЛС отходы производства
Необходимо предотвращения контаминации продукта: 1. асептические условия при культивировании микроорганизмов 2. стерильность процесса стерилизация ферментера, воздуха, питательных сред и т.п. Очистка воздуха: фильтрация Фильтр предварительной очистки компрессор холодильник влагоотделитель фильтр грубой очистки (волокнистые материалы: стекло, базальт) фильтр индивидуальной очистки для каждого ферментера (тонковолокнистая материя: картон, бумага)
|
Задача 26 Несмотря на то, что в основе современной инженерной энзимологии лежит применение ферментов и ферментных систем…. 1. Использование иммобилизованных ферментов – связывание ферментов с нерастворимым носителем при сохранении каталитической активности увеличение стабильности и длительности использования партии ферментов Методы иммобилизации:
2. система, открытая для усложнения в одном реакторе и продуцент и фермент. Пример Бензилпенициллин (иммобилизация) 6-аминопенициллановая кислота амоксициллин, ампициллин, азлоциллин.
|
Задача 27 Правила GMP – это руководящий нормативный документ международного значения, которому должны подчиняться как отдельные фирмы, так и все производство…. GMP - ( Good Manufacturing Practice) - хорошая производственная практика – правила организации производства и контроля качества лекарственных средств, это единая система требований к производству и контролю. Правила GMP - это руководящий, нормативный документ, которому и производство и фирма обязаны подчиняться. Правила GMP обязательны для всех предприятий, выпускающих готовые лекарственные формы (ГЛФ), продукцию медицинского назначения, а также субстанции. высокоразвитые страны), когда препараты идут на экспорт без лишних препятствий. К экспортерам лекарственных средств предъявляются следующие требования:
Подобно Фармакопеям правила GMP неоднородны. Имеются:
Международные правила GMP по строгости требований усреднены, в ряде стран правила более либеральные ( в соответствии с техническим уровнем производства). В Японии национальные правила GMP строже международных. Правила GMP имеют 8 разделов I Терминология П. Обеспечение качества Ш. Персонал
VIII Валидация (утверждение) 8-ой раздел: валидация Валидация - это оценка и документальное подтверждение соответствия производственного процесса и качества продукции установленным требованиям. Директор предприятия специальным приказом назначает руководящего сотрудника или специалиста со стороны для проверки качества работы какого-либо цеха, технологической линии и т.д. Валидация может быть - периодическая,( проводится постоянно) - внеплановая (при чрезвычайных происшествиях, при изменении технологии). Валидация позволяет установить: - соответствует ли технологический процесс регламенту - соответствует ли качество готовой продукции требованиям нормативной технологической документации
При этом составляется отчет, если имеются какие либо не соответствия или нарушения – то производственный процесс прерывается. На биотехнологическом производстве внеплановая валидация проводится если:
|
|
Задача 28 Иногда в клиниках или больницах наблюдается явление внутрибольничной инфекции,… 1.Первоисточник генов резистентности находится в почве у почвенных микроорганизмов — продуцентов антибиотиков.Гены резистентности присутствуют не только в хромосомах,но и в плазмидах. Плазмиды - носители генов информации (всего около 30 генов). Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления клетки. Плазмиды могут содержать гены резистентности (устойчивости) к разным антибиотикам. Плазмиды с генами резистентное™ легко передаются из клетки в клетку при конъюгации микроорганизмов. При этом двойная нить плазмиды расходится на две отдельные нити и одна остается в клетке донора, а другая передается реципиенту. Особенно часто это явление наблюдается в больницах (внутрибольничная инфекция). Коньюгация м/о может быть не только внутривидовой, но и межвидовой и даже межродовой; возможна «вспышка» - вся микрофлора может стать резистентной к антибиотикам. 2.Гены резистентностимогут присутствовать в хромосомах(передаются только при делении клетки)или в R-плазмидах(появ-ся в результате «мобилизации «генов из хромосом ,передаются конъюгацией) Хромосомная локализация-изменение конформации внутр.мишени Плазмидная локализация- фермент.инактивация а\б=полирезистентность. 3.Пути преодоления резистентности ß-лактамов: -поиск ингибиторов ß-лактамаз-клавулановая кислота,сульбактам и производство комплексов а\б +ингибитор-уназин,аугментин.
|
Задача 29 Метод биотехнологии получения ЛС на основе культур клеток растений имеет широкое распространение,… Тотипотентность - это способность любой клетки образовывать полноценное растение, что предопределено его генетическим и физиологическим потенциалом (или естественными возможностями), необходимым для образования вторичных метаболитов. Стабильность по выходу продукта вторичных метаболитов связывают с двумя параметрами:
1.Технология получения каллуса- Выбранный эксплантант, представляющий вырезанные маленькие кусочки (2-4 мм ) растительной ткани, которые находятся в подходящем биологическом состоянии (они молоды, здоровы ), что необходимо для получения каллусных культур. Этот растительный материал тщательно моют, стерилизуют гипохлоридом натрия, 96% спиртом или 0,1% сулемы, затем тщательно промывают дистиллированной водой и помещают на синтетическую агаризованную питательную среду. Сосуды закрывают ватно-марлевыми тампонами. Конечно, при этом необходимо соблюдать строгие правила антисептики (работают только в боксах). Для образования каллуса и роста ткани сосуды переносят в темное помещение, где строго поддерживают определенный режим. Это касается температуры и влажности. Известно, что для большинства культур эти параметры таковы: температура +24-26 °, а влажность 65-70%. Через 2-3 недели на раневой поверхности образуется первичный каллус. Стадии: -латентная -линейная -экспоненциальная -стационарная -отмирания Суспензионная культура выращивается в биореакторе(глубинное культивирование)-увел.биомассы и вторичн.продуктов при перемешивании. В качестве примера можно привести превращение дигитоксина в дигогсин клетками Digitalis lanata. Недеференцированные культуры клеток Digitalis lanata сами не образуют сердечных гликозидов, но могут осуществлять реакции биотрансформации субстратов, добавленных в питательную среду. Биотрансформация дигитоксина в дигогсин идет за счет реакции 12-гидроксилирования, катализируемой ферментом, находящимся в клетках Digitalis lanata.
|
Задача 30 В настоящее время существует проблема недостаточной эффективности хорошо зарекомендовавших себя ранее ЛС… 1. Механизм возникновения резистентности:беталактам реагирует с «пенициллин связывающим белком» (конкретным РВР)-изменение конформации белка-изменение параметров-сигнал передается на трансмембранный белок-белок на внешнюю поверхность-сигнал передается на белок-репрессор,регулирующий экспрессию гена ß-лактамаз-синтез белка на рибосоме 2.О хромосомной и плазмидной локализации структурных генов беталактамаз. Гены беталактамаз, особенно цефалоспориназ, локализуются в бактериальной хромосоме. Однако, все чаще их обнаруживают и в плазмидах. Плазмиды не находятся под столь строгим регуляторным контролем в клетке как хромосомный генетический материал и могут существовать во многих копиях, что повышает количество генов беталактамаз и уровень самих ферментов в клетке. . Наиболее важно то обстоятельство, что гены беталактамаз, локализованные в плазмиде, могут передаваться при конъюгации вместе с плазмидой в другую клетку. Это означает, что плазмидные гены быстро распространяются по клеточной популяции, для чего не нужно даже деления клеток
Транспозоны представляют генетические элементы ДНК, способные самостоятельно перемещаться в пределах репликона (генома), а также к перемещению из одного репликона (хромосомного, плазмидного, фагового)в другой. Многие транспозоны при этом перемещении несут детерминанты устойчивости к антибиотикам (например, к канамицину, хлорамфениколу, тетрациклину, эритромицину. При встраивании в ген транспозонов, несущих детерминанты устойчивости к антибиотикам, появляются мутанты с двойным фенотипом. Во-первых, инактивация гена сопровождается утратой функции, которую он контролирует. Во-вторых, экспрессия генов этого транспозона приводит к лекарственной устойчивости. Практически теряется терапевтическая активность антибиотиков. 3. Ген фермента модифицирующего мишень может иметь не только хромосомную, но и плазмидную локализацию. Особенно часто плазмидная локализация генов резистентности встречается при ферментативной инактивации антибиотитиков. Иногда в одной плазмиде оказываются локализованными несколько генов, кодирующих ферменты, воздействующие на антибиотики разных групп. Отсюда возникло понятие полирезистентности микроорганизмов. Полирезистентные штаммы возбудителей инфекций представляют серьезную проблему в инфекционной клинике, вызывая так называемую «госпитальную инфекцию», когда к тем антибиотикам, которые используют в инфекционной клинике возникает устойчивая резистентность со стороны возбудителей различных инфекционных заболеваний и лекарственные препараты - антибиотики теряют свою активность.
|
|
Задача 31 Важнейшие группы антибиотиков, образуемых грибами – пенициллины и цефалоспорины… Механизм биосинтеза бензилпенициллина: схема
Широкий спекр.Используются при -пневмонии -эндокардите -инфекциях кожи,мягких тканей,слизистой. -сепсис,менингит 1. Предшественники ß-лактамных антибиотиков. ß-лактамные антибиотики синтезируются из аминокислот L-цистеин, L -валин, L -аминоадипиновая кислота, из которых синтезируется LLD-трипептид (L -валин превращается в D-валин). Из линейного LLD-трипептида образуется лактамное кольцо, затем образуется пятичленное серосодержащее кольцо. Антибиотики не являются продуктом матричного синтеза. 2.Механизм действия ß-лектамных антибиотиков Они ингибируют синтез пептидогликана клеточной стенки на последнем этапе, подавляя активностьфермента транспептидазы. Транспептидазы соединяют концы пептидных цепочек, на концах которых находится D-аланин, а ß-лектамные антибиотики являются аналогами D-аланина и связываются с активным центром фермента, тем самым инактивируя его. В результате пептидные цепочки не замыкаются.=гидролиз пептидогликана. 3.Требования к производству по системе GMP Учитывая аллергенность ß-лектамов их производство ведут в отдельных помещенияхПоападание пенициллина в продукцию может вызвать нежелательные последствия-рекомендуется использовать отдельные емкости,трубопроводы.
|
Задача 32 В настоящее время доказано, что полностью избавиться от генорезистентности невозможно,… Потребность периодического обновления используемых в медицине антибиотиков обусловлена постепенным распространением в микромире вариантов резистентности к антимикробным препаратам.. Спонтанные мутации - отнюдь не единственный источник генов резистентности. У аминогликозидов, существуют ферменты, модифицирующие или трансформирующие молекулу собственного антибиотика таким образом, что последний инактивируется. 1.. Химическая трансформация тетрациклинов. В медицинскую практику было внедрено несколько продуктов химической трансформации природных тетрациклинов. Наиболее важным из них является доксициклин (6-дезокси-5-окситетрациклин). Доксициклин гораздо дольше циркулирует в организме, чем природные тетрациклины.Это стало возможно благодаря выделению 6-АПК. . Создан ß-лактамный антибиотик Имипипсм, который в растворе образует цвиттер-ион, меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает через узкие пориновые каналы. Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые каналы, адругим способом, например, с помощью имитации структуры переносчика. Есть пептидогликана, ингибируя транспептидазу). -цефалоспорины Ш поколения не расщепляются Р-лактамазами, но они являются индукторами выработки Р-лактамаз, - цефалоспорины 1У поколения (Цсфспим) не являются индукторами Р-лактамаз. 3^ аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика, поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом 2. Активный выброс. часто встречающийся механизм тетрациклино-резистентности обусловлен изменениями, происходящими в оболочке, точнее в цитоплазматической мембране бактериальной клетки. Известно, что в клетках новые белки, появляющиеся в цитоплазматической мембране при тетрациклинорезистентности являются белками, составляющими систему активного «выброса» тетрациклинов, проникающих в клетку. Иными словами, тетрациклины проходят через оболочку бактериальной клетки, в том числе и через цитоплазматическую мембрану, однако, они не успевают прореагировать с рибосомами, так как быстро удаляются или «выбрасываются» в среду.
|
Задача 35 Витамины, как группа незаменимых органических соединений различной химической природы, необходимы любому организму… С помощью биотехнологии сегодня производят особо сложные по строению витамины В2, Bi2, Р-каротин (провитамин А), РР и предшественники витамина Д (эргостерина), в синтезе витамина С (аскорбиновой кислоты) используют микроорганизмы как селективные окислители d-сорбита в L-сорбозу. . 1.Биообъекты Рибофлавин- разработан как химический, так и микробиологический способы промышленного синтеза- культура дрожжеподобного гриба Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii, Bacillus subtilis Витамин В12 микробиологический синтез в промышленном масштабе- пропионовокислые бактерии из рода Propionibacterium. Аскорбинка -в основном химический синтез и лишь одна стадия осуществляется биотехнологическим способом с применением уксусно-кислых бактерий, проводящих реакцию трансформации d -сорбита в L-сорбозу. Для получения сорбозы культуру продуцента Gluconobacter oxydans Витамин PP. Используется биотехнологический метод, метод экстракции из микроорганизмов, обычно из пекарских дрожжей с добавлением предшественников. Используется штамм - Brevibacterium ammoniagenes Эргостерин-дрожжи
2.Суперпродуценты Рибофлавин -сверхсинтез рибофлавина можно получить, если действовать на дикие штаммы мутагенами, нарушающими механизм ретроингибирования синтеза витамина Вг, флавиновыми нуклеотидами, а также изменением состава культуральной среды. В состав среды для роста продуцентов рибофлавина входят: соевая мука, кукурузный экстракт, сахароза, карбонат кальция, хлорид натрия, витамины, технический жир. Был сконструирован рекомбинантный штамм продуцента Bacillus subtilis, способный синтезировать в три раза больше по сравнению с Eremothecium ashbyii и этот продуцент более устойчив к экзогенной кантаминации Витамин В12-применение мутантов и добавление в среду предшественника витамина Bi2 - 5,6 диметилбензимидазола (5,6 ДМБ) резко повышает продуктивность продуцента. Этому способствует также добавление в питательные среды кукурузного и мясного экстракта, соевой муки, рыбной муки. Выращивание пропионовых бактерий производится периодическим методом в анаэробных условиях на среде с кукурузным экстрактом, глюкозой, солями кобальта и сульфатом аммония. Образующиеся кислоты нейтрализуются щелочью. Через 72 часа после начала ферментации вносят предшественники - 5,6 ДМБ. Длительность ферментации - трое суток. Полученную массу сепарируют, стабилизируют нитритом натрия, охлаждают, нейтрализуют, коагулируют белки и фильтруют. Очищают на ионообменной смоле, кристаллизуют и проводят химическую очистку продукта. Далее следует получение различных лекарственных форм поливитаминных препаратов. Для увеличения производства витамина Bi2 перспективным является применение генной инженерии при получении гибридных штаммов и использовании методов иммобилизации на полимерах
3.Преимущества это производство является высокорентабельным (не требует дорогостоящего оборудования), экологичным (не использует агрессивных токсических соединений в качестве сырья), стабильным, безвредным для обслуживающего персонала.
|
|
Задача 34 В основе любого производства фармацевтических препаратов, в том числе биотехнологического,… 1.Необходимо сочетание биосинтеза и орган. синтеза ,т.к. существует много видов ант\резистентности. Механизм создания полусинтетических пенициллинов: а) отщепление бензильного радикала (остается о-аминопенициллановая кислота - 6АПК). б) введение других радикалов химическим путем. Так же идет работа с цефалоспоринами: радикалы присоединяют к 7-аминоцефалоспориновой кислоте (7АПК). У некоторых клеток есть гены, которые делают мембраны непроницаемыми для антибиотиков (сужаются поры или снижается их количество). Способы борьбы с этой резистнтностью . Создан Р-лактамный антибиотик Имипипсм, который в растворе образует цвиттер-ион, меньший по размерам, чем пенициллин и легко проникает через узкие пориновые каналы. Могут быть созданы структуры, которые проникают не через пориновые каналы, адругим способом, например, с помощью имитации структуры переносчика. Есть пептидогликана, ингибируя транспептидазу). -цефалоспорины Ш поколения не расщепляются Р-лактамазами, но они являются индукторами выработки Р-лактамаз, - цефалоспорины 1У поколения (Цсфспим) не являются индукторами Р-лактамаз. 3^ аминогликозидный антибиотик Амикацин имеет фрагмент гаммаоксимасляной кислоты в структуре канамицина защищающий этот антибиотик от инактивации со стороны изоферментов этого антибиотика, поэтому этот антибиотик отличается высоким терапевтическим эффектом. Теория взаимозаменяемости антибиотиков. 2.Аминокислоты получают хим-энзиматическ методом9коричная кис-та-фенилаланил).Получают α-изомеры(в хим. Синтезе-смесь).=дорого,сложно. 3.Витамины с помощью биотехнологии сегодня производят особо сложные по строению витамины В2, Bi2, Р-каротин (провитамин А), РР и предшественники витамина Д (эргостерина), в синтезе витамина С (аскорбиновой кислоты) используют микроорганизмы как селективные окислители d-сорбита в L-сорбозу.
|
|
Задача 36 Особенно заметно достоинства биокатализаторов проявляются при модификации пространственной структуры стероидных соединений…формула
Вещ-во R→Corinebacterium mediolatum→вещ-во S→гидрокортизон→Mycobacterium globiforte→преднизолон формулы -аэробный процесс глубинной ферментации.Транформация может осуществл-ся растущей на среде культурой или отмытыми от среды клетками м\орг .Важно:чистые культуры,асептические условия, Причина низкой производительности ферментации несмотря на высокий выход по субстрату:нераств.в воде,токсичность растворителей,невозможность использования высоких концентр. субстрата
|
|
Задача 37 Наукоемкое и высокоэффективное производство, являясь мало энергозатратным, дает возможность значительно уменьшить количество отходов,…
- использование более активных биообъектов- продуцентов; - замена сред и реагентов на менее дефицитные; - иммобилизация биообъектов (многократное использование); - внедрение мембранной технологии выделения и очистки; - соблюдение правил GMP. 2. твёрдые отходы (мицелий): - переработка мицелия : перемешивание с почвой и помещение в ямы----почв. Микроорганизм используют мицелий.
Жидкие отходы ( культуральные жидкости) : активир-е- искуственн. Биоценоз- сообщество микроорганизмов, окисляющих растворённые в жидкости органич-е вещества до углекислого газа и воды: Pseudomonas (70%), Bacterium (20%) etc. Если концентрация антимикробных веществ велика, клетка может погибнуть, следовательно необходимо использование штаммов-деструкторов-клетки (генная инженерия), содержащие плазмиды, несущие гены окислит. Ферментов. Далее очищенная вода поступает в водоёмы. Газообразные отходы. Очистка при температуре 300-1000 С в колонках с неорганическими катализаторами. Органика переходит в углекислый газ.
|
Задача 38 Востребованность препаратов на основе живых культур микроорганизмов-симбионтов (нормофлоры, пробиотики) не вызывает сомнений…
-эффективная антагонистическая активность (синтез органических кислот); - способность прикрепляться к эпителию кишечника; -Не гидролизуют кишечную слизь; - не повреждают стенки кишечного эпителия; Требования к биообъектам: 1) отсутствие патогенности и токсичности, 2) Хороший рост на искусственных питательных средах, 3) криорезистентность, 4) выдерживание высушивания.
Они ауксотрофы-питательная среда должна содержать микро, макроэлементы, витамины, и т.д (белок молока, дрожжи, соли магния, марганца, цинка, глюкоза) Культивируют 8-16 часов, собирают в той же фазе роста, при которой выживание будет наиболее длительным. (конец логар фазы, начало стационарной фазы)----суспензия----центрифугирование+раствор криопротектора---заморозка в жидком азоте----лиофильная сушка----флаконы. 3. Применение. Бифидумбактерин, апилак, колибактерин, бифилак, бификор, лактобактерин, бификол.
|
Задача 39 Аминокислоты известны как составные элементы белков. Методы получения :
2) Штаммы-суперпродуценты. Это микроорганизмы с нарушенной системой регуляции. Их получают воздействием мутагенов физич или химич природы с последующей селекцией. Например: продуценты лизина- синтез лизина контролируется треонином и лизином, которые подавляют активность аспартокиназы. Если убрать треонин, получим суперпродуцент. 3) Подбор питательной среды. Если блокировать синтез треонина, то нужно добавлять его в среду. Если блокировать в другом месте цепи биосинтеза, то мутаген будет нуждаться в метионине и треонине. Если их добавить в среду в ограниченном количестве, то штамм будет расти, пока их не израсходует. После исчерпания треонина, штамм начнёт синтезировать лизин. Также в среду необходимо добавлять источники углерода, аммонийного азота, минеральные соли, ростовые факторы и т.д.
|
|
Задача 40 Иммунобиотехнология вносит весомый вклад в создание ЛС, профилактических и диагностических препаратов.
Пассивный иммунитет- интерлейкины, интерфероны и др цитокины. Иммуносупрессоры. IgE-связыв. Молекулы, иммунотоксины, антицитотоксические АГ, моноклональные АГ против цитокинов.
АТ- белок (Yg), синтезируемый В-лимфоцитами в ответ на проникновение в организм АГ и специфически с ними взаимодействующий. Эпитоп- фрагмент молекулы АГ, локально внутри или на поверхности молекулы , индуц иммунный ответ. Гаптен- низкомолекулярное соединение . При присоединении их к молекуле, организм вырабатывает АТ (ЛС).
А. активное воздействие-вакцины. Б, пассивное воздействие: - специф: поликлональные АТ –на инфекц агенты, токсины. - неспецифич: интерлейкины, интерфероны.
|
Задача 41 Вакцины и сыворотки, как известно, применяются с целью профилактики или лечения.
А) живые вакцины : - аттенуированные: естеств. Штаммы микроорганизмов с ослабленной вирулентностью ( при действии мутагенов, температуры, радиации); - дивергентные : непатогенные м/орг, имеющие общий антиген с патогенным м/орг (оспа); -рекомбинантные ( ген гепатита В в эшерихии коли). Б) Неживые вакцины : - корпускулярные: убитые культуры патогенных м/организмов или извлечённые компоненты протективных АГ ( спирт, фенол, те-ра, УФ, радиация). - молекулярные : АГ в виде эпитопов ( пол-ие биологическим синтезом: бактерия---токсин---анатоксин); В) комбинированные вакцины: АКДС (дифтерия, столбняк (анатоксины) + коклюш (АГ) )
Получают путём иммунизации домашних животных---забор крови-----плазма----сыворотка. Применение- профилактика и лечение инфекции-х заболеваний, отравление ядами (ботулизм), укусы змей, диагностические цели. |
Задача 42 Известно, что главным компонентом иммунохимической реакции являются антитела (иммуноглобулины),…
АГ+АТ= АГАТ (1) АГАТ+АТ= АГ(АТ)n (2)
АГ-поливалентен и для повышения чувствительности и специфичности тестов в 1 из компонентов вводят маркёр АГ + АГ* + АТ= АТАГ + АГ*АТ Если в пробирку с Ра-ром, содержащим постоянную концентрацию АТ и АГ*, добавить разные количества немеченого АГ , то концентрация комплекса АТАГ* будет обратно пропорциональна концентрации немеченого АГ. Чтобы отделить комплексы АГАТ от несвязанных компонентов смеси, АГ или АТ связывают с твёрдой фазой (Гетерогенный анализ).
|
|
Задача 43 Вполне очевидно, что биосинтез ЛС проводится в асептических условиях.
Доза: 2,5 Мрад Установки: гамма-установки, ускорители электронов и др. Механизм: микроорганизмы теряют способность к размножению и гибнут вследствие повреждения ДНК. Режим стерилизации: так, чтобы стерилизационная доза (2,5 Мрад) набиралась за сутки ( в гамма-установках) или за несколько секунд ( в ускорителях электронов).
- белые порошки становились матовыми; -красные и желтые порошки тускнеют; Стекло мутнеет, темнеет, но сохраняет функциональные свойства. Потемнение обратимо ( несколько месяцев).
|
Задача 44 Сегодня производство иммунодиагностикумов можно рассматривать как самостоятельную область биотехнологической промышленности…
- контроль банков крови и продуктов из донорской крови; -обнаружение возбудителей в объектах окружающей среды; - диагностика заболеваний; - диагностика диабета.
М-д гибридомной технологии. Гибридома- клетки-химеры, результат смешения опухолевых антителообразных клеток. Они способны к неограниченному росту в культуре и к продукции АТ определённой специфичности ( моноклон. АТ).
На полистирольные шарики собираются моноклональные АТ к хорионическому гонадотропину. К сенсибилизированным шарикам добавляют конъюгат, состоящий из маркёра и моноклон. АТ, иммоб на поверхности шариков, а другой- с моноклон АТ конъюгата с маркёром. Затем определяют активность фермента в составе иммунных комплексов с помощью субстрата- хромогенной смеси. Интенсивность окраски пропорциональна количеству гонадотропина.
|
Задача 45 Биотехнологическое производство в фармацевтической промышленности – это система устройств,… Ферментёры : - с механическим пермешиванием, - с внутренней рециркуляцией - с внешней системой циркуляции. Изготавливают из коррозионно-стойкой стали. Объем- 10-100 кубических метров. Это вертикально расположенный цилиндр с полукруглым дном, где есть отверстие для слива культуральной жидкости. В верхней части- крышка с вводами : для пит среды, посевного материала, воздуха; выход- для воздуха, прошедшего через питательную среду. В центре-мешалка. Во внутреннем пространстве есть «отбойники», предотвращающие возникновение «мёртвых зон», Есть наружная рубашка, обеспечивающая постоянство температуры. Стерилизация : поверхности ферментёра, трубопроводов, воздуха, пит. Среды. Заполняется на 2/3
|