spory

Билет №1. Определите роль современной биотехнологии…

1). Б/т-направлен научно-технич прогресса использующее биологические процессы и агенты для целенаправлен воздействия на природу, для промышленного получения полезн для ч-ка продуктов, в т. ч. лек. ср-в. Б/т-наука кот на практике исп-ет достижения молекулярн биологии и генетики, биоорганич химии. Позволяет решать задачи, кот ставит перед фармацией практич медицина (про-во а/б, вит, гормонов, алкал и др).

2). Биообъект - продуцент, биосинтезирующий нужный продукт, либо катализатор, фермент, кот катализир одну присущую ему реакцию. Б/т исп либо продуценты - микроорганизмы, раст, высш животн, либо изолирован индивидуальные ферменты. Фермент иммобилизуется (закрепляется) на нерастворимом носителе, что позв его исп-ть многократно.

3). Классифик биообъектов:

Макробиообъекты: человек (донор крови, органов, гормонов); млекопитающие (инсулин свиньи, скота); рептилии (яд змей); рыбы; насекомые; растения (селекция и отбор серд гликозиды).

Микрообъекты: 1. Эукариоты (низш грибы, водоросли). 2.Прокариоты (актиномицеты, бактерии, сине-зел водоросли). 3.микробиос-мы (ферменты, протопласты)

4). Для совершенств биооб исп-ют: наследственные изменен фенотипа и генотипа (мутации), стандартизация накоплен сырья и выход, сокращение срока культивир, промышленное получение биомассы редко встречающихся растений.

Билет №5. Обоснуйте перспективы геномики при создании новых ЛС…

Структурная геномика-имеет целью определение последовательности нуклеотидов и генов.

Сравнительная - сравн последоват нуклеотидов в исследуемом образце и стандартном. Сравн г-ка выявляет мишень для скрининга антимикробных агентов (узк, широк спектра д-я, высокоизбират)

Функциональная г-протеомика. Геном в кл м б сопряжен с белками, но этих белков в орган нет, гены не экспрессируются. Протеомика дает возможность опр-ть какие белки есть в организме, а каких нет. М-д 2-х мерного электрофореза.

Существенность генов - это их необходимость в осущ-ии жизни клеток.

Билет №2. Привидите усл-я, необх при произ-ве ЛС с позиций ваших предс.

1). Требования к продуцентам: безвредность; активность биосинтеза, скорость роста и накоплен биомассы; стабильность по производит; чувствит к усл культивирования (аэрации, рН, Т); потребность в источнике углеводов и азота.

2) Параметры влияющ на биосинтез:

- Т (бактерии 28^оС, актиномицеты 26-28, грибы 24)

- Число оборотов мешалки

- Расход воздуха

- Давление в ферментере

- рН среды

- парциальное давление растворенного в воде кислорода

- конц СО2 при выходе из ферментера

- потребление пит в-в

- паличие посторонней микрофлоры

- определение в процессе ферментации биол активности

3). Селекция - получен новых и совершен сущ-ющих биообъектов (клеточн культуры, штаммы) путем отбора, мутагенеза или гибридизации. Всю селекцион работу делят на след этапы:

- выработка цели и плана исследования

- подбор исходных форм объектов

- вызывание изменчивости, отвечающей селективной цели

- отбор необх форм и их доработка

- закрепление полученной изменчивости в наследственности

- испытание и размнож наиболее совершен продуцентов при модификац изменчивости: наследуется способность биобъектов, в рез приспособления к усл развития - опред изменен признака.

Сущ-ет форма изменчивости меняющая генотип (мутационная). Способность к мутированию одно из св-в гена. Б/т со временем стала исп-ть традицион м-ды селекции естественно отобранных, размножение наиболее перспективных штаммов. Знач более эфективн явл селекция клонов, получен в рез-те мутагенеза.

4). длительн хр клеток без утраты ценных св-в возн если резко затормозить все протек в них жизн процессы в т ч и генетич перестройки (культура в анабиоз): лиофильн высушивание (обезвоживание под вакуум после замораж); высуш на возд в стерильн почве; сохр спор; криоконверсия (замораживан с послед хр в жидк азоте; комбинир.

Билет №3. Представьте ваши сведения о возм исп-я клеточн инженерии в созд лс

1). Клеточная инженерия - техника обмена фрагментами ДНК, участками хромосом у прокариот и любыми хромосомами у эукариот. Нет видовых и родовых барьеров, осущ обмен генетич материалом между организмами, кот в обычн усл не вступ в полов прцесс. Техника кл инженерии основана на технике протопластирования. Протопласт - кл без кл стенки, окруж цитоплазм мембраной. Протопласт получают обрабатывая кл ферментами, кот гидролизуют полимеры в кл стенке.

2). Клетка окружена кл стенкой, поэтому кл не сливаются, сливаются только протопласты. Чтобы снять кл стенку исп-ют лизоцим (бактерии), кот гидролизует гликановые нити, виноградную литку (грибы). Как только удаляется кл стенка, происх лизис всей клетки, но если работать в гипертонич среде (20% декстрозы или 10%NaCl), то целыми остаются протопласты.

Слияние протопластов в среде ПАВ в полиэтиленгликоле, кот нарушает кл цитоплазму и ДНК двух протопластов объединяются. Для облегчения слияния кл делают компетентной (обрабат кл тяж мет, проводят быстр заморозку и разморажив клеток, обрабат кл ферментами)

3). гибридные а/б мужду антрациклинами и макролидами; моноклональные антитела (лимфоциты и опух кл). В рез протопластирования происх активация молчащих генов.

Билет №4. Обоснуйте возм генетич инженериипри созд ЛС на

1). Отличие ген инженерии от клеточн, в ген инжен имеют дело с изолирован ДНК, in vitro.

Суть технологии: соединение фрагмента ДНК в пробирке с последующим введением изолированной ДНК в живую кл. С помощью ферментов эндонуклеаз (напр рестриктазы)

2) Техника:

- получение ДНК чужеродного фрагмента, кот необх включить в кл хозяина.

- получение плазмиды из кл донора. Есть кл-реципиент (из кот получ плазмиды). Вектор-рекомбинант (часть рекомбинантной ДНК) кот обеспечив проникновение и дальнейшую репликацию этой ДНК в кл хозяина

- введение фрагмента ДНК в плазмиду кл-реципиента. РИС

- включение вектора в кл-реципиент (кл д б компетентной, т е увеличить ее проницаемость (возд на кл тяж мет, фементами, быстр заморажив и оттаивание) цитоплазм мембрана д близко подходить к кл стенке). Вектор внутрь кл ч/з пили.

- Отбор гибридных клонов (идет по маркеру)

Маркер – запрограмир и включен в плазмиду св-во.

Билет №8. Представьте АБ, образ актономицетами:

Актином-ты-многокл бактерии предст собой кольцевую хромосому, не отделенную от цитоплазмы ядерной мембраной, не имеют ядра (вместо него 1 замкнутая нить ДНК), они прокариоты, не имеют митохондрий, имеют сложн цикл развития (5-6 суток), во вр кот их мицелий претерпевает дифференциацию. Образуют спороносцы и споры. Кл стенка сост из гетерополимера- пептидогликана.

Всего ~12 тыс природн а/б, из них 9 тыс продуцируют актином-ты. Ак-ты продуцируют а/б, ингиб синтез белка на рибосомах бактер клеток, а также противогрибк и противоопух а/б. Ак-ты продуцир а/б:

-аминогликозиды-ингибир синтез белка у бактерий, связываясь с малой рибосомной субъединицей, наруш правильность считывания кодонов мРНК антикодонами тРНК (канамицин, неомицин)

-тетрациклины-ингибир белковый синтез, связывая аминоацил-тРНК рибосомально-матричным комплексом (окситетрациклин)

-макролиды (гр эритромицина)-связыв с больш субъединиц рибосомы (эритромицин)

-пиранозиды- гр линкомицина (как макролиды)

-левомицетин (хим синтез)-ингибир пептидилтрансферазу больш субъединицы

-рифампицин-подавл акт ДНК-зависимую РНК-полимеразу (блоктир синтез белка на ур-не транскрипции)

-противогр (полиеновые а/б)-блеомицин -обр поры в цитоплазматич мембране грибов, взаимодействуя с эргостеролом (нистатин, леворин)

-противоопух а/б-угнетают синтез нукл к-т кл микро- и макроорган (митомицин, брунеомицин).

Таргетный скрининг – позв в соотв с выбором гена вести отбор БАВ, в частности АБ с заплан мех-мом д-я в отличие от традиц метода, когда поиск ведется «от клетки к гену». 1 этап скрининга – выделение гена из генома. 2 этап – исп-ся ПЦР для амплифицирования гена (созд-ся вирусный вектор, кот вводится в плазмиду). 3 – кол-во копий гена умножается. 4 –конструируются: а) бесклеточная с-ма, где наработ матрица служит для получи РНК, специфичной для гена; б) бесклеточная рибосомная с-ма, где эта иРНК служит для наработки белк. Продукта, кодируемого данным геном.

Билет №6. Опр-те знач АБ для чел с позиций ваших представлен:

АБ- в-ва, образуемые микроорг и избират подавляющие рост др микроорг. Вторичные метаболиты. 1929-Флеминг-пенициллин. АБ обусловлен демографич взрыв в нач 20 века, они имеют огромн соц значение. Стоимиость годовой продукции АБ 19 млрд $, выпуск ежег сотнями тысяч тонн. АБ-ср-во преодоления стрессовых ситуаций для м-мов. Они появ одновр с АМК, нуклеотидами. АБ реликтовые молекулы, явл избират ингибиторами метаболизма, имеют акцепторы в высших клетках, явл вторичными метаболитами. Полусинтетич АБ-природн АБ модифицир ферментным или химич путем.

Важн черта-избирательность д-я на мебатол-м. Из неск ты ср-ий подавл только 1 или неск. в мал конц-ии (1 мкг/мл и меньше).

Продуцентами явл многие роды и виды микроорг, больш продуцентов выделено из почвы, но есть и др (ил, морск вода). Как правило, продуц АБ явл такие почвенн мкорг как плесневые грибы, актиномицеты, спорообразующие бактерии.

Первый скрининг 20 век (случайн открытия по антимикробн активн, оценка активности in vitro, in vivo, выявл мех-ма д-я, клин испыт; 21 век (выбор генов мишеней в геноме патогена, наработка матрицы, испытан активн потенцияльных ингибиторов, клинич испытан.

Структ геномика – идентифик генов с пом комп программ. Функц геномика – устан связи м/у геномом и метаб-м; или отд геном и метаб р-ями. Существенность генов-необх-ть этого гена для жизнед-ти клетки. При создании АБ эти существ гены (т.е. кодируемые ими белки) д.б. мишенями. Новая технология скрининга отличается от традиц, базируется на сиквенировании всего гена. Междунар базы данных дают информацию о: 1. Распр гена среди патогенов.2. Кодир этим геном продукт (белок). 3. Об участии этого прод-та в метаб проц.4. О том, какую р-ию катализирует этот продукт

Сравнительная геномика – позвол устан, явл ли изуч ген уник, или он уже был идентифицирован. Таргетный скрининг – позв в соотв с выбором гена вести отбор БАВ, в частности АБ с заплан мех-мом д-я в отличие от традиц метода, когда поиск ведется «от клетки к гену». 1 этап скрининга – выделение гена из генома. 2 этап – исп-ся ПЦР для амплифицирования гена (созд-ся вирусный вектор, кот вводится в плазмиду). 3 – кол-во копий гена умножается. 4 –конструируются: а) бесклеточная с-ма, где наработ матрица служит для получи РНК, специфичной для гена; б) бесклеточная рибосомная с-ма, где эта иРНК служит для наработки белк. Продукта, кодируемого данным геном.

Билет №7. Представьте АБ, образ плесневыми грибами:

Плесн гр отлич от высших гр отсутс плодового тела. Гр-организмы кот имеют ядро, митохондр с ферм, кл стенку, содержащую хитин. Плесн грибы-многоклет мкорг, имеют сложн цикл развития (6-7 суток), широко распростр в почве, относят к эукариотам. Они формируют разл виды мицелия, обр-ют сотни разл а/б, но исп некотор ПЦ и ЦС-беталакт АБ.На основе природных ПЦ и ЦС получены полусинт их аналоги. Помимо а/б грибы исп для получен антидепр-та-циклоспорина, фузидина-а/б в основе кот лежит стер ядро серд гликозидов. Дрожжи явл продуцентами витам и ферментов. ПЦ и ЦС обр-ся Penicillium, Cephalosporium.

В наст вр сущ 4 поколения: 1-цефазолин; 2-цефуроксим; 3-цефоксим; 4-цефипим, кот д-ет на резист штаммы, не разруш β-лактамаз. Быстро проник в грам-, подавляют трансамидазу пептидогликана, не появл резист штаммы во время лечен, нет индукции β-лактамаз. ПЦ наруш с-з микробн стенки микробн кл м-ма, нах-ся в фазе деления.

В отлич от перв метаб-в АБ не обнаруж в 1 сутки роста культуры. Мах их накопления на 5-6 сут. Биол роль: 1. АБ предназн для уничтожения мкорг, конкурирующих с продуцентом в почвенных биоценозах. 2. Явл эффекторами дифференциации мицелия или спорообраз-я. Явл ср-вом преодол стрессовых ситуац для продуцента.

Билет № 9. Объясните роль сравнит идентификации аб на начал этапах исслед-я…

К хим м-дам опр а/б относ: 1)прямое т-е, прямое потенциометрич т-е фузидиевой к-ты (точн навеску к-ты р-ют в С2Н5ОН и т-ют NаОН в среде ф/фт до св розов окр-я. 2)косвен иодометрия. На АБ сущ х-ные специф р-ии: эритромицин +HCl+ ванилин-> оранж-крас ТЦ флуоресц. Стрептомицин+ NaOH+ Квасцы-> Фиол окраш, хроматографир-е. Если имеет спектр поглощ в УФ, то можно просматривать в лучах УФ-лампы.

После заверш ферментации культуральн ж-ть перед на выдел а/б и очистку. Культ ж-ть содерж а/б, мицелий продуцента, продукты его лизиса, комп пит среды. 1)предвар обработка культуральн ж-ти-отделен а/б от суспензии мицелия и комп культ ж-ти, нах-ся в коллоидном сост-ии. Если часть а/б нах в мцелии его переводят в водн фазу, напр меняя рН культ ж-ти. Иногда раствор-й а/б и а/б, связанный с мицелием объед-т в общ осадке, из кот а/б экстрагируют. Исп способы коагуляции, флокуляции. Отделен нативного р-ра от мицел и коллаг частиц осущ м-дами фильтрации, центрифуг. Исп барабанные вакуум-фильтры, фильтр-прессы, сепараторы. 2)Выделение АБ - Получ а/б в виде индив в-в: экстракцион м-ды оч-ки (экстракц орг р-лем исп для оч ПЦ и эритромицина, при переходе в орг р-ль происх освоб соотв а/б от примесей). Потом упариванием получаем АБ. Варьируя рН и меняя т.о. раств-ть АБ в воде, м многократно переводить АБ из одной фазы в другую, освобождаясь каждый раз от определ кол-ва примесей.; м-ды ионнобменной сорбции-исп-ся для аминогликоз, не р-мых в орг р-лях. Десорбция Н2SО4. Мембранные технологии – комплекс приемов-для раздел слож смесей. 3) метод осаждения. Очистка: адсорбционная хроматография, ионообменная хр, аффинная хр.

КО: 1) биол м-д титрования. На стерильные диски закапыв разл V АБ. На чашку в углах. (тр разл кол-ва стандарта, в других р-р АБ). 2) хим титр-е (удобнее). –Прямые (оттитр по функц групп), - Косв ( напр для пениц) Разруш в-в образ щелочью -> пролдукты дегидрации -> йод. Изб J2+Na2S2O3. 3) Антрацикл группу опр по интенс окраш в срав со стандартом – колориметрич м-дю 4) СФМ (наиб удобен). ТЦ (реактив- хлориж Fe) 5) ВЭЖХ –оч точный- опр-ся родственные примеси целевого прод-та- Циклоспорин. 6) Радиоакт м-д – измерение в-ва пров по радиоакт метке, используя изотопную метку определенной группы в предшественнике. Бензилпенициллин (изотопом метят ФУК и опред-т его кол-во по масс-спектру)

Билет № 10. Определите слагаемые боитехн пр-ва в системном подходе…

Б/т пр-во имеет разную степень сложности по протяжен технологических цепей. Быстрое пр-во, когда целевой продукт явл биомасса (получ дрожжей, при получен бифидумбактерий); отдаленный процесс, когда конечным продуктом явл лп (напр а/б).

Схема произ-го процесса:

Выращ посевного материала

*Подготовка и стерилиз техн-го возд-ха

*подготовка стерилизация герметизац оборудования

*стерилизац пит сред

Биосинтез (ферментация)

Выделение и очистка БАВ

Приготовление препаративной формы БАВ

Биосинтез в ферментере может осущ-ся когда в ферментере имеется продуцент и он освобожден от посторонних м-мов. Ферментация грибов-7 суток, 24С; актиномицетов-до 5 дней 26-28С; бактерий 1-2 суток 28С;

Факторы: T, число оборотов мешалки, расход подав на аэрацию возд, давл-е, рН, парц давл О2, конц СО2, биохим пок-ли.

Подготовит этапы:

-подготовл посевного материала или инокулята, куда входит ряд этапов от засева пробирок и колб до проведения выращивания в засевном ферментере. Многоэтапное выращ посевн материала-обязат принцип биотехн про-ва.

-Подг пит среды, кот включ выбор и реализ рецептуры среды, стерил-ю, гарант сохр-ть всех пластич и энергетич комп-в в исход-м кол-ве и кач-ве;

- подг ферментацион оборудования, гарант от попад в процесс контамин флоры.

Основные этапы:

- биосинтез и разделение (отделен биомассы от культур среды)

-конценрирование

-очистка (ультраф-ция, экстракция, сорбция, кристаллизация)

-получение конечной субстанции или гот ЛФ, расфас, упак.

Кл-я биосинтеза:

I. По принципу орг-ии матер потоков: период-й, полупериод, непрерыв, отъемно-доливной, многоцикли

II. По х-ру культ-я продуцента: поверхн-я фермент-я, глубинная.

III. По принц целевого прод-та: биомасса; высокомолек индивид вва (фермент и т.д.); низкомолек первич метаболит; низком вторич метаболит.

Билет № 29.

Поддерж-е нормальной микрофлоры ЖКТ и борьба с дисбактериозами становится актуальной задачей современной медицины.Решение внедрение в практику препаратов на основе живых культур симбиотических микроорганизмов-пробиотиков(или микробиотиков,нормофлоров).Важный компонент-молочнокислые бактерии-лактобациллы,энтерококки,бифидумбактерии.Пробиотики создаются на основе безвредных обитателейЖКТ.Известны пр-ты-колибактерин, бифидумбактерин,лактобактерин,бификол.Пробиотики-это штаммы болгарской палочки,выделен.из простокваши.В ряде исследований было доказано,что молочно-кислые бактерии обнар-т противоопухолевую активность.Она связана с тем,что эти микроорган-ы обезвреж-т канцерогены.

Билет № 30. Обоснуйте предпочтительность выбора пробиотиков или а/б при:

В процессе эволюц создалось множество партнерс отношений м-ду м-мами и организмом. Тесное сожит 2-х разл орг-мов-симбиоз: мутуализм-благопр для обоих; паразитизм; нейтрализм; компенсализм. Совокупность м-мов обитающ в ЖКТ-микрофлора-полостная и пристеночная. Основные обитатели кишечника: бифидобактерии, лактобактерии, энтерококки,, энтеробактерии-киш палочка, клостридии и др. Все эти м-мы обр нормальн микрофлору, они синтезируют вит, аминок-ты, орг к-ты, ферменты и др. Молочнокислые бактерии (доминир полож в ЖКТ)-симбионты чел-ка и животн. Размнож на поверх эпит киш-ка, обеспеч подавл развития патоген и гнилост бактерий; расщепл лактозу, метаболиз холестерин, ↓его сод-е в сывор крови; прояв противоопух актть, обезвреж канцерогены, стимул имун р-ции орг-ма.

Мех-м подавления гнилост бактер: продукция молоч к-ты и ↓рН; обр-е перекиси водорода; обр-е антибиотич в-в (ацидофилин); обр-е на поверх киш-ка биопленки, кот препятст фиксации патогенов; изм-е окисл-востан потенциала-неблаг среда для аэробов.

Широк примен а/б-дисбактериоз, что прив к подавл молочнокисл бактер, усилен разм киш палочки, протея, анаэр клостридий, дрожжей. В связи с этим внедрен препаратов на основе живых культур симбиотич м-мов – пробиотиков (микробиотики или нормофлоры), важн компон кот молочнокисл бактер-лактобациллы, энтерококки, бифидумбактерии. Примен а/б привело к появл уст форм м-мов, произ-во а/б загр окр среды, плохо для персонала. Всех этих недостатков лишены пробиотики.

Препараты нормофлоры: колибактерин-на основе штамма киш палочки E. Coli м-17; бифидумбактерин-Bifidobacterium bifidum штамм лва-3; лактобактерин-живые кл лактобацилл.

Процесс получения нормофлоров и пробиотиков вкл этапы культивир-я бактерий на спец разраб средах, отделение их биомассы, смешивание конц бактерий с наполнителями и добавками, полупродукт фасуют и высушивают. Обычно исп сух монопреп-ты, готовая форма-бификол (смесь коли- и бифидумбактеринов).

Примен чаще педиаторы и инфекционисты: острая дизентирия, сальмонелез, вирусн диареи, ишерихиоз и тд.

Наиб популярны нормофлоры среди педиаторов инфекционистов,использ-х пр-ты колибактерин, бифидумбактерин,бификол,лактобактерин при острых кишечных инф-х(в комплексном лечении острой дизентерии,сальмонеллёза,эшерихиоза,вирусных диарей и др) при длит.кишечных дисфункциях стафилококково этиологии, а также для лечения реконваесцетов после острых кишечных инфекции при продолж-ся дисфункции кишечника.Прты показаны детям с отягошённым премор бидным состоянием:родившимся преждевременно или с признаками недоношенности,получ-м а/б в раннем неонатальном периоде:детям,матери кот страдали тяжёлыми токсикозами,экстрагенит-ми заболеваниями,имели длител-й безводный период или другую патологию;детям матерей имеющих лактостаз,тре-

щины сосков,после мастита,ослабл-м детям с анемией,гипотрофией,рахитом, диатезом,при заболев-х коклюшем,при переводе детей на искусств-ое вскармл-ие.Нормофлоры назн-т при воспален-х тонкого и толстого кишечника(колиты и энтероколиты),при наруш-х чистоты вагинального секрета у беременных женщин.Показания к применению пр-тов очень широко,однако,в наст врем они как и другие пр-ты нормофлоров произв-ся в стране недостаточно и ставится задача увеличения объёма их выпуска

Билет № 22. Укажите, что предусматривает выбор посевных и фермента-ционных сред, если учесть:

Посевн среда д б богата пит в-вами. Для высокопродуктивной ферментации необх собл опр усл-я. Продуценты а/б выращ на разн средах, чаще комплексных. В них могут входить соевая/хлопковая мука/ кукур экстракт и др природн многокомпонентн источники пит в-в. В среды вносят некотор индивид орг соед-я, мин соли. Для кажд штамма-продуцента состав отдельный. Общие особенности: 1) глюкоза, фруктоза, сах-за, галактоза – сильные репрессоры проц биосинтеза. Продукты метаболизма глюк подавляют с-з функций. 2) высокое сод фосфатов неблагоприятно в виду обогащения клетки макроэргическими фосфорными соед-ми (АТФ), что ↑ скорость роста мицелия, накапл много биомассы, но мало а/б. Совсем иск фосфор не нужно, но избегать избытка; 3)аммоний усилив рост продуцентов, но отрицат влияет на б-з а/б. Соевая, хлопковая мука (медлен расщипл)-из них медлен освобожд-ся аминок-ты, ионы NН4. Посевной материал-небольш по отношен к объему пит среды в ферментере объем культур ж-ти с выросшей молодой культурой. Выращ посевн матер-ла произв-ся в отд спец апп-те.

Наприм усл ферментации а/б: в среде не д б глюк (легко усвояем источник углев)-лучше крахмал; источн аммонийного азота-соевая мука; небол конц фосфора.

Выращ посевного матер: продуцент может хр разными способами, например на скошен агаре. С поверх скошенного агара перенос в колбы с жидк пит средой. После накоплен биомассы и проверки культ на чистоту 0,5-1% посевн материала переносят в инокулятор. В нем происх рост и деление м-мов. Из инокулятора 2-3% материала перенос в посевн апп-т, из посевн апп-та 5-10% посевн мат-ла перенос в ферментер.

Билет № 11. Предложите в кач-ве слагаемых б/т процесса, если это касается подготовит операций стерилизации:

Б/т произ-ва, функционир в фарм пром-ти – это конгломераты устройств периодич или непрерыв д-я, ан-з которых оправдан с позиций системн подхода.

1. Технологического воздуха – стерилиз технол воздуха (воздух проходящий ч/з ферментер). Исп-ют фильтрацию ч/з с-му фильтров (др способы не подходят, т.к. очень большие объемы воздуха). Возд с улицы→фильтр предвар очистки от пыли и влаги→компрессор (сжатие возд при этом возд нагревается)→холодильник→возд под давлен-ем ч/з головной фильтр→индивидуальн фильтр (не должен пропускать более 0,25 микрона). Фильтры стерилиз острым паром 120С, 30 мин

2. Питательной среды – пит среда перед подачей в культиватор д.б обеззаражена. Для этого надо решить 2 задачи: полн-тью уничтожить всю контаминир микрофлору, содерж в потребн для культивир-я объема жидк-ти, и сохранить ее биол полноценность. Стерилиз термическим нагреванием насыщ водяным паром при повыш давл-и. Реже прибегают к стерилиз с помощью хим реагентов или же лучевых физ возд-й (УФ, ионизир радиация). В случае исп-я термич стерилизации эф-ть выбран режима обеззараж-я оценивают по критерию Дейндорфора – Хэмфри. Для обесп-я контроля за ходом стерилиз исп-ют споры тест-микроорг-мов. Решая задачу по гарант стерильн-ти пит среды следует помнить, что режим обеззараж не должен снижать ее биол полноценности.

3. Ферментера – При выборе ржима стерилиз прежде всего оценв степень герметиз оборуд-я и коммуник, а также налич-е устройств, предупрежд возм-ть загрязн-я посторонней микрофлорой внутр пов-тей. Особ вним-е обращ-ют на нал-е «слабых точек» (в них при неправ подобр режиме не достиг-ся треб t стерилиз). К ним относ тупиков штуцера малого диаметра и штуцера от датчиков контрольно-измер аппаратуры (манометры, термометры, электроды).

4. Вспомогательного оборудования – стерилиз и герметизац оборудования. Ферментер и все трубопроводы стерил насыщ паром при130С 1 час. Для проверки эффект стерилизации проводят пробн стерилизацию с исп-ем биолог теста. Особое внимание «слабым точкам» - тупиковые штуцера малого диаметра, штуцера от датчиков аппаратуры.

Билет № 12. Докажите (представьте) преимущ-ва б/т процесса, осн на исп-и иммобилизации биооъектов, применяя:

1) Иммобилизация - физич разделение биообъекта (клетка, фермент) и раств-ля, т.е биообъект закреплен на нерастворимом носителе, а субстрат и продукт свободно обмениваются между биообъектом и р-лем. Биооб может работать многократно (неделя, месяц).

Преимущ иммоб-ии биооб-ов: многократность исп-я ферментов иживых клеток в наиболее продуктивной фазе; снижение кол-ва отходов; повыш кач-ва целевого продукта (менее загрязнен), более простое выделение целевого продукта (важно для пр-ва инъекц ЛП-когда в продукте мало белка, нет пирогенности и аллергенности). Носители-в-ва орг (фибрин, целлюлоза) и неорг (акт уголь, песок, бентонит) природы. Максим нагрузка носителя-макс кол-во фермента, кот м б иммобилизованно на опр-ом кол-ве носителя.

2) М-ды иммоб-ии:

- адсорбция на нераствор носителе (недостаток-связи, в основном ионные, м б недостаточно прочными и разруш под д-ем рН и др, при этом биооб снимается сносителя, исп редко)

- адсорбция на афинном носителе (избир сорбция к опр-ой гр в-в)

- ковалентное связывание

- включение биооб в носитель или инкапсулирование. Биооб вкл-ся в ячейки геля, субстрат проникает в ячейки, целевой продукт свободно выходит (сложности: если бииоб-изолированный очищен фермент-ячейки не д б слишком большими, но если маленькие затруднен контакт с субстратом; если биооб-клетки, то ячейки д б дост большими (достаточн доступ О2 и отведение СО2). Связь с гелем не очень прочная, биооб может вымыватся.

3)Типы: очищенный фермент; фермент сохр-ся в кл с коферментом; фермент в пермеабилизованной кл (в кл у кот повышена проницаемость); интактная кл с полной функ-ой акт-тью (кл-продуцент);

4) Система открытая для усложнения: кл+фермент+…и т д (биосинтез продукта и его трансформация в одном биореакторе).

Билет № 14. Обоснуйте значение правил GLP и GCP с позиций:

GLP-пр-ла орг-ции лаборат исслед-й. При испытан нового ЛС необх провести испыт-я в лаборатории прежде чем приступить к клиническим испытаниям. Лаборат испытания (in vivo, in vitro) проводятся на клетках, бесклеточных с-мах и животных. При испытан на животн можно получить разл рез-ты, важна правильная организация исследований. Животные д б гетерогенны, корм д б постоянным, животные д б жизнеспособными, исключен стресса.

GCP-пр-ла орг-ции клинич испытаний. ЛС допускается к клинич испытаниям только после проведения лаборат. В пр-лах изложены права б-ных и добровольцев: испытуемые д б информированы о том, что им вводится новый ЛП и о его св-вах; б-ые имеют право финансовое вознагражд-е; д.б контроль за ходом испытаний со стороны медиков. В Европе, США, России сущ общественные комитеты по контролю за клинич испытаниями (священники, милиция, медицинская общественность). Цель клинич испытаний: получение достоверных результатов (лекарство лечит и оно безвредно).

1) Эффект-ть новых ЛП – испытывается начала на клетках и животных.

2) Безопасность новых ЛП – новые ЛП д.б безопасны и изучены сначала в лабораторных условиях.

3) Соблюдение прав добровольцев и пациентов – описано в правилах GCP.

4) Достоверн-ти рез-татов – внедрение ЛП на рынок начинается только после доказанной клинической эф-ти и безоп-ти, рез-ты исследованй д.б достоверны.

Билет № 15. Предложите пути и укажите задачи в преодолении антибиотикорезистентности:

Классиф мех-мов антибиотикорезистент-ти у микроорг-мов:

1. Изм-е конформации внутриклет мишени для данного АБ (т.е. антимикробн агент проникает в кл-ку, но мишень его не связывает)

2. Уменьш-е прониц-ти об-ки микробн кл-ки для АБ.

3. Появл-е в об-ке кл-ки системы активного «выброса» проникающего в кл-ку АБ – его конц-ия не может стать высокой.

4. Ферментативная инактив-ция АБ защитным ф-тами. Самый эффективн тип защиты микробной кл-ки.

1) Исп-я понятие о плазмидах – Больш знач-е играют плазмиды-носители генной информации. По размеру они значит-но меньше хромосом. Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления кл-ки. Плазмиды, несущие ген резистентности к АБ, получили назв-е R-плазмид. Плазмиды могут содержать гены резистентности к разным АБ. Плазмиды с генами резистентности легко передаются из кл-ки в кл-ку при конъюгации микроорг-мов, при этом двойная нить плазмиды расходится на две отдельные нити и одна остается в кл-ке донора, др в кл-ке реципиента.

2) Данные о стр-ре плазмидах – Плазмиды представляют собой кольцевые молекулы ДНК. Плазмидная резистентнось редко встречается лишь в случае 1 из перечисл выше мех-мов. Причиной антибиотикорезистентности, вызванной изм-ем конф-ции внутриклетмишени, явл-ся спонтанные мутации в структ гене, определяющем стр-ру той макромол-лы, с кот, как с мишенью связ-ся АБ. Мутировавшие хромосомн гены в принципе м.б «мобилизованы», т.е оказатся в плазмидах и быть переданы за счет мех-мов распростран-я плазмид в др клетки. Однако переноса резистентности в большинстве случаев не произойдет. В новой кл-ке-хозяине будут работать хромосомные (свои) и плазмидные гены и в рез-те часть мишеней будет чувствит-на к АБ, а часть – резистентна. В таких случаях антибиотикочувствит-ть доминирует над резистент-тью.

3) Понятие коньюгативных транспозонов – Транспозон — генетический элемент, реплицируемый в составе репликона и способный к самостоятельным перемещениям (транспозиции) и интеграции в разные участки хромосомной или внехромосомной ДНК.

4) Понятие о госпитальной инф-ции – Особенно часто это набл в б-цах (внутрибольничная инфекция). Конъюгация микроорг-мов м б не только внутривидовой, но и межвидовой или межродовой: возможна «вспышка»-вся микрофлора может стать резистентной к АБ. Первоисточник генов резист нах в почве.

Борьба с резистентностью:

- Создание полусинт пенициллинов (отщепление бензильного радикала, остается 6-АПК (6-аминопенициллановая к-та); введение др радикалов хим путем) для борьбы с β-лактамазами.

- Создание ингибиторов β-лактамаз (комбинир пр-ты-уназин, амоксиклав, аугметин).

Билет № 18. Приведите хар-ку беталактамных а/б с точки зрения:

β-лакт а/б обр-ся 2-мя родами плесн грибов: Penicillium, Cephalosporium. Β-лакт а/б ПЦ и ЦС. Обязат и важн часть их молек от кот завис антимикр активн-весьма реакционноспособное β-лакт кольцо.

Плесн гр (продуценты)-отс плодового тела, эукариоты, имеют ядро, митохондрии. Строение: БП

М-м д-я: ПЦ наруш с-з микробн стенки микро-ма, нах-ся в фазе деления. Выд 4 поколения ЦС: 1-цефазолин, цефалексин; 2-цефуроксим; 3-цефоксим; 4-цефипим, кот д-ет на резист штаммы не разруш β-лакт-з. Быстро проник в кл грам-, подавл трансп, не появл резист штаммы во время лечен, нет индукции β-л-з.

GMP: нас ферментац указание на карантин, котрому должно подвергаться сырье; на необх статистич критериев вариабельности компонентов сырья; на необх проверки опр видов сырья на пирогенность.

(м-м д-я β-лакт а/б: ингибир синтез пептидокликана кл стенки на посл этапе, подавляя акт фермента транспептидазы. Транспептидазы соедин концы пептидных цепочек, на концах кот нх Д-аланин. Β-лакт а/б явл аналогом Д-аланина- пептидн цепочки не замыкаются.)

Билет № 16. Представьте преимущ-ва получения биомассы ЛРС м-дом культивирования клеток:

Тотипотентность-способность кл растен образовывать полноцен растение. Стабильность по продуктивности вторичн метаболитов связыв с дифференцировкой кл и со стадиями культ-я.

Каллус (утолщение на дер-ях, «мозоль»)-получена в 1902г, как модельная с-ма для биол объектов. Дифференцированные корневые каллусы A. Bellad. Могут синтезировать тропан алк, недиф нет. Это характ при процессах метабол эф масел, млечного сока, когда отс структур со специализ кл приводит к исчезновен данных в-в.Для обеспечен роста и синтеза продуктов вторичн метаболизма необх подбор ингрид среды культивир. Компон среды должны вкл: микроэл-ты, основн неорг пит в-ва (макроэ-ты), источник Fe, орг добавки (регуляторы роста, вит), источ С. Регул роста растен явл пусковыми мех-ми вторичн метаболизма. Исп ауксины (индол-3-уксусн к-та), цитокинины (6-бензиламинопурин). На синтез влияют внесен-е в пит среду предшественники, кот могут стимулир-ть опред ферментативн пути мет-ма. Также влияют свет, Т, рН, а при скспензион культивир аэрация и перемешивание, скорость вращения сосудов, газовый состав. Для накопл промыш сырья исп каллусные и суспен культуры. Преимущ-ва калус культ-надежность, стабильность по выходу биомассы, возм исп-я для иммобилиз и послед биотранс. Выход продукт втор мет выше вкаллусн культ, чем в сусп-х. Растит кл иммобилиз путем встраивания в альгинат Са или внедряют в 3-х мерные сетчатые стр-ры. Такие стр-ры исп для наперстянки. Биотрансф-м-д, использующий ферменты, локализ в кл растения и способные менять функ-ые гр добавленных из вне хим соединений. М-д пригоден для повышения биол акт данной конкретн хим стр-ры и осущ-ия серии специф хим р-ций, за счет вкл-я доного или неск последоват связан ферментов.

Интантные раст-ничем не обработан (никотин, кодеин, диосгенин, хинин).

Источники получения каллусн культ-ры: листья, побеги, корни, почки, пыльца. Кл д б молодые и здоровые.

Этапы: пригот оборуд; приг пит среды; стерил оборуд и среды; посев ткани на пит среду; выращ биомассы; съем сырой биомассы, высушивание.

Латентная фаза (привык); экспотенциального роста (макс митотич активность); линейн рост каллус ткани с постоян скоростью; фаза замедл роста (интенс деления резко сниж); стационарная; отмирания. Оптим усл обр-я первичн каллуса- 24-26С, влажность 65-70%, темное место

Билет № 17. Объясните малую эффект а/б в случае антибиотикорезстентн:

Мех-зм развития резистентности у бактерий:

- появление новых генов в рез-те мутаций

- появление чужеродных генов

- изменен конформации внутрикл мишени для данного а/б

- уменьшение проницаемости оболочки микр кл для а/б (борьба-а/б кот обр-ет цвиттер-ион, кот легко проник ч/з узкие пориновые каналы; проникновение др способами.

- появл в оболочке кл с-мы активного выброса проникающего в кл а/б

- ферментативная инактивация а/б (часто). Больш значение играют плазмиды-носители генной информации. Плазмиды автономно реплицируются (размножаются) независимо от деления кл. Плазмиды могут содержать гены резистентности к разным а/б. Плазмиды с генами резистентности легко передаются из кл в кл при конъюгации м-мов, при этом двойная нить плазмиды расходится на две отдельные нити и одна остается в кл донора, др в кл реципиента. Особенно часто это набл в б-цах (внутрибольничная инфекция). Конъюгация м-мов м б не только внутривидовой, но и межвидовой или межродовой: возможна «вспышка»-вся микрофлора может стать резистентной к а/б. Иногда в одной плазмиде оказ-ся локализ неск генов, кодирующих ф-ции, возд-щие на а/б разл групп- полирезистентность (проблема в инф клинике). Первоисточник генов резист нах в почве.

Борьба с резистентностью:

- Создание полусинт пенициллинов (отщепление бензильного радикала, остается 6-АПК (6-аминопенициллановая к-та); введение др радикалов хим путем) для борьбы с β-лактамазами.

- Создание ингибиторов β-лактамаз (комбинир пр-ты-уназин, амоксиклав, аугметин).

Билет №20. Укажите осн причины необходимости периодического обнов-ления номенклатуры антибиотических препаратов:

Синтез дезокси- и дезаминопроизв аминогликозидов (АГ) привел в тупик. Почв бакт рода Bacillus способная синт-ть АГ а/б, внешне похож на канамицин, но у него 1 из NH₂ групп в аминоциклидоле была замещена R-γ-NH₂-α-маслян к-той-бутирозин. Это в-во оказалось интересно с т з активности. Сохр способн реаг-ть с рибосомой, подавл синтез кл стенки, активность как а/б. Но его продуцент оказался неактивен (дорого). Тогда взяли сущ-сть бутирозина и перенесли на на др АГ-канамицин, получили амикацин, уст-в ко всем γ-гликозид-активирующим. Функции:

- уменьшение проницаемости оболочки микр кл для а/б (борьба-а/б кот обр-ет цвиттер-ион, кот легко проник ч/з узкие пориновые каналы; проникновение др способами.

- появл в оболочке кл с-мы активного выброса проникающего в кл а/б

М-м резист к ТЦ особый. Мол-ла кот инакт ф-ции не найдена. М-м имеет общебиологич значение: акт выброс ксенобиотиков (ксено-чужой). Когда чуж в-во в кл, в цит мембране сталкив с выбросом а/б. Эта с-ма требует источника энергии. В-во выбрасыв-ся против град конц, необх АТФ. Рис

А/б из белка ловушки ч/з белок транспортер передается каналообразующему белку и выбрасывается обратно. У онкологов эта с-ма наз-ся multiplay drug resistence *MDR)

В США широко ведутся работы по разработке ингибиторов энерг процессов (они токсичн и не имеют прим в клинике).

Билет №13. Обоснуйте необходимость внедрения правил GMP в произ-во ЛС с позиций:

ВОЗ ввела в д-е «Систему удостовер-я кач-ва фарм преп-тов в международной торговле» (последний вариант от 1975г).

Для участия в системе необходимо наличие 3-х условий:

- Госуд регистрация ЛС.

- Госуд инспектир-е фарм предприятий.

- Наличие пр-л GMP – пр-л орг-ции произв-ва.

GMP – это единая система треб-й по орг-ции произв-ва, контролю кач-ва ЛС от начала переработки сырья до получ-я готового прод-та.

Пр-ла GMP – явл-ся общим рук-вом, устанавливающим порядок орг-ции произв процесса и контролю испытаний, и содержащих миним практич указания по правильному ведению произв-ва.

В 1991г Министерством мед пром-ти РФ были утверждены «Пр-ла орг-ции произв-ва и контроля кач-ва ЛС», который составлен с учетом международных треб-й и должен был быть введен с 1-1-1992г.

Содержание этих правил – правила GMP - руководящий док-т, кот произ-во и фирма обязаны подчинятся, обязательны для всех предприятий, выпускающих ГЛС, ИМН, субстанции. Пр-ла GMP бывают – национ, регион, междунар.

Разделы: 1) Введение, 2)Терминология 25 пунктов (опр-я ЛВ, ЛП, и тд), 3)Обеспеч-е кач-ва (четкая регламентация всех произв-ых процессов, чистые помещения, совр оборуд-е и тд), 4)Персонал (образ-е, ф-ции, личн гигиена и тд), 5)Здания и помещ-я (пр-ва вне жилых зон, β-лактам АБ проив-ся отдельно, помещ д.б сухими и тд), 6)Оборуд-е (д.б адекватно технол процессу, приборы д.б откалиброваны и тд), 7)Процесс пр-ва и экологич безоп-ть (сертификат кач-ва на сырье, проверка сырья на микр кантаминацию и тд), 8)ОТК-обязат для фарм предприятий. Задача ОТК: не допустить выпуска брака, укреплять произ-ую дисциплину. ОТК контрол сырье и продукцию, уч-ет в планир и проведении постадийного контроля, хранит образцы каждой серии не мен 3-х лет, 9)Валидация (утверждение)-оценка и док-ое подтверждение соответствия произ-ого процесса и кач-ва продукции установл требованиям. Валидация м б : периодическая, внеплановая (при ЧП, изменен технологии). Валидация позвол установить: соотв ли техн процесс регламенту; кач-во готов продукции НД; оборудование произ-ым целям. Составляется отчет, если нарушен то произ-во прерывается. На биотех-ком произ-ве внеплановая валидация если: меняется штамм продуцента, изменена пит среда. Нужна ревалидация в обоих случаях. Перспективная валидация проходит перед внедрением технологич процесса в произ-во. Ретроспективная валидация проводится за опред период времени реально сущ произ-ва. При провед-е валидации допускается эксперимент модельн произв-в в экстрим усл-ях. Валидация оценивает: сам процесс; предел возм откл-й.

Обеспечение качества:

Треб-я для фарм предприятий должны включать ряд мероприятий:

- Четкую реглам всех произв процессов получ-я ЛС.

- Обеспеченность произв-ва квалиф персоналом, необходимыми помещ-ями, оборуд-ем, сырьём, вспом упаковочн материалами высокого кач-ва и утвержд регламентами и инструкциями.

- Регистрацию всех этапов произв-ва, проводимых ан-зов и получ рез-тов.

- Реализацию гот прод-та с последующим сохран-ем регистрацион записей.

- Ср-ва транспортировки.

- Порядок возврата серий ГЛС.

На произв-ве д.б инструкции:

- по получ-ю исходн сырья.

- по хран-ю исходн сырья.

- по отбору проб.

- по провед-ю исходн контроля.

- по исп-ю сырья в процессе произв-ва.

- по обращ-ю с забраков сырьём

Билет №43. Рассмотрите ситемы врожденного иммунитета с позиций:

Основные составляющие и пути функционир имм сис-мы представл в виде схемы:

АГ→имм сист (лимфоидно-фагоцитарная): АТ, лимоциты, лимфокины, интерлейкины, интерфероны, пептиды тимуса и др

В ответ на воздейств биопрепар и агентов окр среды имм с-ма выраб различн регуляторн молекулы, медиаторы, модулирующие постоянство внутр среды орг-ма. Иммуномодуляторы: иммуностимулир и иммуносупресс. В-ва с иммуносупресс акт-ю вошли в клинич практику с необх-ю подавлять р-ции отторжения тканей при пересадке органов и леч аутоиммунных заб. Соврем б/т создана на базе знаний по микробиологии, вирусологии, молекул генетики и генной инж. Стало возможн исп культур кл бакт, дрожжей, жив и раст, метаболизм кот-х обеспечив выработку специф в-в. Б/т рекомбин белков в фарм промыш-ти охватывает произ-во вакц, синтез белково-пептидных гормонов, интерферонов. В орг-ме: 1) специф имм с-ма – специф клеточн и гуморальн иммунитет; 2) неспециф гум с-ма (комплемент) разрушение АГ-АТ, уничтож инородн частиц, активные кл, участвующ в воспалит процессе; 3) неспециф клеточн с-ма (лейкоциты, макрофаги), фагоцитоз.

Вопрос о создании ингибиторов сигнальной трансдукции

В терминал. молекулярной медицине и молек биологии в наст время появилось понятие ингибиторов сигнальной трансдукции. Это биологически активные вещества могут быть весьма перспективны как ЛС в различных областях клиники. Сигнальная трансдукция предсталяет систему явлений или процессов в клетке при реакции ее на внешние воздействия. Последовательность явлений берет начало от рецепторов на поверхности клетки, продолжается как ряд белок-белковых взаимодействий (с участием протеинкиназ) и заканчивается избирательной активацией определенных ядерных факторов транскрипции с последующей активацией тех или иных генов с экспрессии кот и начинается ответ клетки на внешние воздействия. Среди агентов подобного рода обнаружены иммунодепрессанты (применение в трансплантологии, при аутоиммунных заболеваниях), ингибиторы и стимуляторы апоатоза (перспективы применения при старческой дегенерации нервной ткани, при онкологии) в-ва (агенты) обуславливающие реверсию мембраны опухолевых клеток от mΔ R фенотипа к нормальному состоянию.

Билет № 25. Определите роль БАС стероидной стр-ры в жизнедеятельности м-мов, растений и животных, оперируя:

Стероидные гормоны: кортикостер, прогестероны, эстрогены и андрогены. Прим в кач-ве: противовосп, диуретич, анаболич, контрацепт, противораковых.

Основн представит стер пр-тов.

Кортикостероиды прогестагены андрогены эстрогены

Для синтеза этих гормонов исп-ся прир соед-я, кот содер-т стероидн стр-ру: соласодин (из паслена дольчатого), импорт-диосгенин. Из паслена очень дорого, одним из эконом видов сырья-ситостерин, весьма распростр в прир-сод-ся во всех растен и м б выделен из отходов от переработки древесины в целлюл-бумажн пр-ве.

В произ-ве стероидн препа-тов необх осущ-ть направленное ок-е боковой цепи стерина с образованием 17-кетоандростана или 20-кетопрегнана. Наиб подход м-дом явл микробиол ок-е.

Биотрансф-я стероидов-аэробный процесс глубинной ферментации, для проведения кот исп-ся типовое оборудование, отвечающее высокой степени массообмена. Трансформация может осущ-ся как растущей на среде культурой, так и отмытыми от пит среды кл м-ма, что явл предпочтит, поскольку облегчает выделение и очистку целевого продукта, но не все м-мы переносят промышленное сепарирование без потери акт-ти. Разработаны процессы трансформации с исп-ем иммобилиз кл (1,2-дегидрированных, осущ-ых культурой коринобактериум симплекс).

Этап биотрансформации стероидов возможен когда полупродукты поступ в среду в микронизированном виде.

В последние годы разработаны усовершенствованные м-ды биотрансформации, основанные на проведении процесса с больш конц-ей стероидов за счет структурной модификации субстратов-обр-е раствор-ых комплексов включения в циклодекстрин, при этом ↑конц стероида, также показ возм-ть исп-я имм клет дегидрирован культуры в пр-ве преднизолона. При ↑конц субстрата за счет применен комплекса с циклодекстрином. Этот вариант-усоверш процесс дегидрир, т к позвол многократно исп-ть культуру, что прив к эконом пит среды. В случае когда р-мость стероид мала, для проявл присущих м-му фермент активности исп м-ды ↑р-ти в воде стероидов 1)подача стер в р-ли, смеш с Н2О; огранич явл токсичн опред конц-ций р-лей; 2)исп водораствор стер в виде натриевых солей; 3)заключение солей в раствор комплекс с декстрином.

Билет № 31. Рассмотрите аминокислоты с позиций:

Аминок-ты (а/к)-составные эл-ты белков. Биол акт явл только L-стереоизомеры а/к. Чистые L-а/к нах примен в медицине в кач-ве самостоят лечебн преп-ов (L-метионин), в состав смесей для парентер пит-я, в фарм промыш при хим и биохим синтезе ЛС. Получение: хим путем, химико-нзиматич (часто), гидролизом белоксодержащих субстратов, прямой микроб синтез. Регул синтеза: конечн продукт ингибирует акт-ть одного из нач ферментов собственного с-за. Если это недостаточно, вкл 2-ой м-зм: подвал-ся обр-е всего комплекса ферментов, при создании м-мов-продуц эти м-змы д б нарушены. Пит среды: ист-к углерода (исп углеводы или орг к-ты), азота. А/к в целом нейтральны NH2-CH(R)-COOH, но при их обр-ии набл закисление среды (преоб-ют ионы аммония NH4→NH2 гр, в среде остаются лишние Cl, SO4) для поддержания оптим рН и ионов аммония, биосинтез ведут при автоматич рН-статировании аммиаком. Процессы биосинтеза а/к явл-ся эноргоемкими, ферментация обязат д провод в аэробных условиях при интенсивн аэрации и перемешивании (энергия за счет дыхания). Продуценты: фенилаланин-Bacillus subtilis, лизин-ауксотрофные продуценты (коринобактериум), треонин- E. Coli.

Билет № 32. Представьте треонин как целевой продукт биотехн произ-ва:

У E. Coli нет мех-ма согласованного ингибирования ферментативной акт-ти. Лизин по принципу обратн связи ингибир акт-ть своих ферментов, треонин своих. Имеет место репрессия всего комплекса треониновых фрментов при избытке а/к-т треонина и изолейцина. По отдельности ни треонин ни изолейцин не репрессируют синтез ферментов. Продукции треонина удалось достич: 1)изменили 1-ый фермент биосинтеза и сделали его чувств к треонину; 2)↓активность одного из ферментов, синтезирующих из треонина изолейцин→у м-ма хронич голодание по изолейцину и убрали м-зм репрессии: из-за недостаточного кол-ва изолейцина мех-м рапрессии не включается, несмотря на изб треонина; 3)исп-ют м-ды генной инженерии. Т к у м-мов кроме осн-ой хромосомы в кл имеются плазмиды, из основной хромосомы выделили треониновые гены и размножили их на плазмидах→↑кол-во ферментов, синтез-щих треонин. От примесей отд, пропуск ч/з р-р ионообмен смолы, упаривают.

Рис (стр 238). Регуляция биосинтеза треонин у E. Coli

Мутация, делающая (1) фермент нечувств к ингибированию треонином

Билет № 33. Представьте лизин как целевой продукт биотехн произ-ва:

У коринобактерий регуляция биосинтеза лизина осущ-ся только на ур-не управления актив-стью ферментов. Продуценты лизина-Corynobacterium glutamicum. Лизин синтез-ся из аспарагиновой к-ты, кот либо поставляет предшественник для такого синтеза, возникающий под д-ем фермента-аспартокиназы, либо трансформи-руется в предшественник для последующего синтеза гомосерина-треонина. Синтез предшественника лизина ингибируется только тогда, когда в кл имеется повышен конц обоих конечн прод-ов-лизина и треонина. По отдельн ни тот ни др не ингибир акт-ти ключевого фермента. Сверхсинтез можно вызвать нарушив синтез треонина или гомосерина (предшествен). Большинство продуцентов лизина не способны синтезировать гомосерин или треонин. При выращивании таких продуцентов необх в пит среду вносить гомосерин или треонин. За счет этого кол-ва гомосерина/треонина происходит рост биомассы продуцента и пока эти аминок-ты прис-ют в среде, синтез лизина не происходит. Когда треонин исчерпывает свое влияние на рост биомассы и исчезает из среды, начин синтез лизина. Процесс имеет 2-х фазный хар-р: снач нараст биомасса, затем синтез лизина-2-3 суток.

Рис (стр 237) Регул б/за лизина у коринобактерий.

Билет № 34. Сравните биосинтез аминок-т и а/б с целью оптимизации каждого процесса:

При разраб микробиолог технологии получ аминок-т след подобрать усл, обеспечив максимально высокую скорость с-за аминок-ты кл-ками продуцента (не обр спор почв аутотрофы рода Corynebacterium, Brevibacterium, спорообр Bacillus subtilis, E coli). С сам начала ферментации в ферментере поддерж оптим конц источн углерода (углеводы или орг к-ты), аммонийн азота, мин солей, ростовых факторов (белковые гидролизаты), рН, Т, необх вести дробную подачу субстратов. Процесс биосинтеза аминок-т энергоемкий, ферментация должна пров-ся в аэробных усл, при интенс аэрации и перемешивании. В аэробн усл-ях кл продуц получают энергию за счет дыхания. После того как в ферментере наросла активная, синтезирующая аминок-ту биомасса, необх созд усл-я, чтобы кл дольше работали. Для прод лизина в проц ферментации в пит среду вносят комплексн ист-к аминок-т. При синтезе фенилаланина в процессе роста на средах с углеводами синт-ся ацетоин и бутандиол→кл начин лизировать спороваться и прекращ выраб фенилаланин, избежать это можно, если в процесс ферментации вести в усл-ях лимита по источнику углерода (р-р сахара).

Билет № 36. Опишите возможности создания оптимальных условий для роста микроорганизмов, учитывая использование «обвязки» ферментеров:

Ф. (биореактор, культиватор) имеет вид снабженного элиптич крышкой и днищем цилиндрич сосуда, в кот смонтирован ряд внутр элементов: перемешиватель содержимого, диспергатор асептически подаваемой в аппарат газовой фазы, система ввода и вывода обеззараживаемых ингредиентов, теплообменники, отбойники, контрольно-измерительные датчики Изгот из инертного материала (стекла, керамики, нержав стали, титана) Ф. также снабж устр-вом д/внесения посевного матер, д/внес во время ферментации дополн кол-в питат в-в и пеногасителя, д/спуска всей культ жидкости по оконч ферментации

Для достиж оптим усл размнож м-мов ф. необх-мо простерил-ть, затем заполнить стерил питат средой (2/3 V, т к происх вспенивание среды во время ферментации) нужного состава, ввести в с-му посевной мат-л, гарант-ть стабильность газовой фазы, t режим (обесп системой змеевиков или рубашкой ф.) и потребную скорость перемешивания жидкой фазы. Аэрирование кул-ры в ф. происх всдедствие 2-х процессов: подача стрел подогретого до соотв Т воздуха ч/з спец устройства- барботеры, благодаря кот поток воздуха дробится на отдел струйки, и непрерывн перемешив культур жидкости с пом мешалок, конструкция кот м б разл (пропеллерные, турбинные и др) Важно, чтобы весь V жидкости в ф. одинаково перемешивался и не создавалось «застойных зон» Хорошего массообмена по газ фазе - дыхания, хор м. по жидкой фазе (перемешивания) – подвода питания и отвод метаболитов. При этом к-ки не д. подвергаться механ, тепловым и др стрессовым воздействиям. Известны и примен 2 способа перемеш: перемеш мех устр находящимся в жидк фазе (ложка в стакане), перемеш за счет продувки газ фазы ч/з жидк – аэрлифтное, барботажное. Недостатком биореакторов с мех мешалкой явл: поверхностный массообмен в аппарате по причине хаотичного, неорганизованного перемеш недостаточен для многих культур к-к и микроорг-мов. В процессе перемеш обр высоко турбулентные и застойные зоны, вследствие чего подвод питания клеткам осуществляется неравномерно. Конечн цель всех манипуляций – обеспеч-е микробиообъектов энергет субстратом и пластическим мат-лом, создание оптим усл для массообмена м/у биосис-мой и средой техногенной экол ниши, а в итоге надо получить биомассу потребной монокультуры. Параллельно воздух выходит в виде пузырьков, чтобы улучшить аэрацию. В момент работы мешалок, с боков могут созд-тся мертвые зоны, кот удаляются отбойниками.

Регуляция (р.): соврем ф. позвол осущ частую дробную подачу отдел пит в-в среды, поддерживать т.обр. оптим д/б скорость роста продуцента, его кит биомассу, т е максим биомассу, пр кот еще не происх наруш снабжения О2, поддерж оптим д/б АБ знач рН культ жидкости Регул осущ по сов-ти параметров, характ метеболич акт-ть культуры-скорость потребления угл, азота, О2, вязкость культ жидк, конц-ция биомассы, морфолог состояние мицелия Эти парметры д непрерывно замеряться и изменятьсч в зав-ти от хода протекания конкретн ферментации Аэрация(а.) Важность а. д/обесп роста продуцентов на стадии ферментации обусл тем, что бол-во из них –аэробы О2 необх-м и непосредственно д/б ряда АБ

для каждого штамма-продуцента состав оптим д/биосинтеза(д/б) АБ среды подбир отдельно Интенсивн биосинт АБ способствует значит уменьш в среде источников углерода и азота Углеродкатаболич р.Глюкоза-источник углер и энергии д/любых орг-мов Однако быстрый катаболизм глюкозы резко сниж биосинтез АБ Катаболическая репрессия-подавление синтеза опред ферментов продуктами катаболизма глюкозы и др легкоокисл соед-ний (сильнее репрессоры-глюкоза, фруктоза, сахароза) Медленно утилизур полисахариды (крахмал) более благоприятны д/б АБ Сод фосфатов высокое содерж в среде фосфора неблагопр д/с АБ Причина- обогащение к-ки макроэргич фосфорными соед-ми, что увелич скорость роста мицелия Накаплив много биомассы, но относительно мало АБ Азоткатаболич р. Аммоний и др легкоутилизир источники азота подобно легко окисляемым углеродам усилив рост продуцентов, но отрицат влияют на биосинетз АБ Соевая, хлопковая мука медленно расщепл в процессе ферментации, т е из них медленно освобождаются аминок-ты, ион аммония, поэтому указанные источники азота явл компонентами пит среды, позволяющ получать высокий выход АБ

Билет № 37. Рассмотрите иммунобиотехнологию (ИБТ) ЛС с

ИБТ основана на реакции АГ + АТ. ИБТ – раздел б/т, включ научную разработку, создание технологии произв профилакт, диагност и ЛС с исп регуляторов и эффекторов имм сис-мы

АГ→имм сист (лимфоидно-фагоцитарная) →АТ, лимфоциты-эффекторы, лимфокины, интерлейкины, интерфероны, пептиды тимуса и др

На имм систему постоянно действ бол кол-во разнообразных биол-ки активных агентов (микроорг-мы, низко и высокомолекул АГ. А часть вводится в виде вакцин и иммуномодулирующих ЛС) В ответ на возд-е биопрепаратов и агентов окр среды имм с-ма выраб разл регуляторные мол-лы, медиаторы, эффекторные мол-лы и к-ки. По типу воздействия способа усиления имм ответа разделяют на акт и пасс. Акт иммунизация (вакцинация): выдел препар получ на основе: рекомбинантных протективных АГ; живых гибридных вакцин. Пасс иммунизация (сыворотки, иммглоб): АТ против токсинов и инф агентов: поликлональные АТ. Неспециф пасс имм воздействия эфф-ны рекомбинантные интерлейкины, интерфероны. Вакцины ввод для профил. При прививке активир-ся имм с-ма, вырабат-ся АТ лимфоцитами, кот сохр-ют в памяти эту способность и при повторном попадании АГ, обр-ют комлекс АГ-АТ, кот распознается орг-мом и утилизируется.

Живые вакцины бактерийного пр-я (сиб язвы, чумы, туб); жив вакц вирус пр-я (оспы, кори, гриппа, краснухи); нежив вакц для проф бакт инф (коклюш, дизент) и вир инф (герпес).

По получ: 1. А) живые бакт вакц – выращ в ферментере чистые ослабленные культуры. Б) вирусные – путем культ-я штамма в культ животн кл. 2. Молекулярн вакц спец АГ выдел из микробн массы, очищ и концентрируют. Токсины обезврежив и получ анатокс. 3. Корпускулярные вакц – получ из микр клетки см вопрос39

Билет № 39. Какова роль бактериальных и вирусных вакцин как профилактических средств биотехнологического производства:

Иммунопрофилактику и иммунотерапию инфекц заб-ний проводят с пом:

- вакцин, в т.ч. анатоксинов (препаратов индукции активного п/инфекционного иммунитета за счет мобилизации мех-мов иммунологической памяти);

- иммунных сывороток и иммуноглобулинов - препаратов, сод готовые специфич АТ, введение кот в орг-м приводит к немедленному приобретению пассивного гумор иммунитета

- иммунокорригирующих средств (интерлейкинов, факторов роста, интерферонов, цитокинов).

Вакц – препараты, пригот из убитых или ослабленных болезнетворных м-мов или из их токсинов, примен для иммунизации с целью профил или леч-я. Вакц сост из: действ компонента (специф АГ), консерванта (для сохр стер), стабилизатора (для продол ср годн), полимерного носителя (для повышения иммуногенности – св-ва Аг вызывать иммун ответ). В роли исп: живые ослаб м-мы; нежив убит микр кл; АГ-структуры, извлеч из м-ма; продукты жизнедеят м-мов.

Общ треб к в.: 1. Высокая иммуногенность (либо иммуностимулирующее, либо десенсибилизирующее действие). В идеале иммунитет, создаваемый вакцинами, д. приближаться к иммунитету, формирующемуся после инфекц процесса, поскольку последний явл наиболее напряженным и полноценным. 2. Ареактивность (отсутствие выраженных поб р-ций). 3. Безвредность и минимальное сенсибилизирующее действие. Вакц делят на:

- жив – получ из: естеств штаммов м-мов с ослаб вирулентностью (оспа); искусств ослаб штаммов; векторные вакц – получ генно-инж способом (оспа со встроенным АГ гепатита В)

- нежив вакц: молекулярн, получ хим синтезом или биосинтезом (анатоксины дифтер, столб, бутулинич); корпускулярные – получ из целой микр кл, инактивированной t, УФ или хим в-вами.

- комб вакц – поливакцины, кот иммунизируют сразу от неск инф, напр АКДС- анатоксин коклюш-дифтер-столб

Токсины – продукты ж/д м-мов (бывают экзо- и эндо-) Анатоксины- препараты, сод инактивированный токсин, вырабат микробом. (Токсины - экзо- и эндо Эти препараты обесп выработку иммунитета к токсину соотв возбудителя. Используются вместе с адъювантом.(дифтерийный, столбнячный, газовой ганрены.) Пригот (выделение + адъювант) Токсины получают путем фильтрования жидкой пит среды или исслед материала, где размножались токсигенные бактерии. Анатоксны получают путем обработки токсинов формалином(0,3% ) при Т 37,5-39, 5 в теч 30 дней. При этом токсин теряет токсич св-ва, но сохраняет антигенные. Адъюванты (помогающий, поддерживающ) – компонент иммунизируемого препарата, необх1) для более длительного сохранения в орг-ме в месте введения;2) для повыш иммуногенности, допустим, гаптена (полиионы) 3) Адъювант м. б.с иммуностимулятором Напр, адъювант Фрейнда (неполный = минер масло + эмульгатор; полный = минеральное масло +БЦЖ).

Прим: Вакц вводят в орг-м для профил. При прививке активиз имм с-ма, выраб-ся АТ лифоцитами, кот сохр в памяти эту способность и при повтор попад этого АГ образ к-к с АГ-АТ, кот распозн орг-мом и утилизируется. ½ из всех вакц, примен в наст вр – живые вакц: бактерийного происх-я (язва, чума, туберк), вирусного (оспа, корь, грипп, краснуха, полиомиелит). Нежив вакц для проф бактер инф (коклюш, дизент, холера, бр тиф, сып тиф), вирус инф (герпес)

Получ вакц:

1. Жив бакт вакц – в ферментере выращ чист ослаб культуру (выращивание, стабил-ция, сантдарт-я, лиоф сушка);

Вир жив вакц – культ-е вирус штамма в курин эмбрионе или в культурах живот кл-к. 2. Молек вакц – выдел из микробн массы, очищ и конц-ют. Токсины обезвреж и получ анатоксины. 3. Корпуск вакц – культивир в ферментере микроб кл, кот инактивир t, УФ, хим в-вами.

Билет № 40. Рассмотрите роль сыворток, как профилактических средств:

Примен сывороток: 1. Сыв исп для предупрежд и леч инф заб. 2. Исп при отравл ядами микробов или животн – при столбн, ботулизме, дифтерий (инакт экзотоксинов), примен сыв от яда кобры, гадюки. 3. Сыв м исп для диагност целей (беремен). В данн случае АТ исп в р-ях обр-я к-ксов с АГ, при этом подтверждается наличие АГ

Профилактич и леч действ основано на содерж-ся в сыв АТ. Для массового получ сыв вакцинируют ослов или лошадей. При введении сыв обр-ся пассив иммунитет (орг-м получ готовые АТ).

Получ сыв: обычно сыв получ путем иммунизация животных, после кот контроллируют титр АТ у животных и в период их наибольшего содерж у них берут кровь, выделяют плазму, удаляют фибрин – получ сыв.

Получ сыв из культивируемых животн кл (проблемы – обеспеч стаб роста жив кл) 1. Нужные нам клетки д преобладать в культуре, д быстро адаптироваться к нов усл и быстро расти. Д б полная стер-ность, стер пит ср, Н2О дист. 2. Если кл будут расти in vitro, то они теряют способность к дифференциации, дегенирируют, трансформируются. Норм жив кл растут только на поверхности, т.к. субстрат-зависимые кл, сонослойная культура. Кл растут в стороны до закрытия поверхности. Рост клеток м б достигнут за счет увелич средн массы, за счет увелич числа клеток.

АТ-содержащие биопрепараты вкл антимикробные или антитоксич АТ и исп для лечения или диагностики. Антисыворотки исп по жизненным показаниям с целью экстренной серопрофилактики (при непосредственной угрозе заб-ния). Кровь, плазма (переливание). Сыворотки.   Антисыворотки

Прим с.: 1. Сыв исп для предупрежд и леч инф заб. 2. Исп при отравл ядами микробов или животн – при столбн, ботулизме, дифтерий (инакт экзотоксинов), прим сыв от яда кобры, гадюки. 3. Сыв м исп для диагност целей (беремен). В данн случае АТ исп в р-ях обр-я к-ксов с АГ, при этом подтверждается наличие АГ

Профилактич и леч действ осн на содерж-ся в сыв АТ. Для массового получ сыв вакцинируют ослов или лошадей. При введении сыв обр-ся пассив иммунитет (орг-м получ готовые АТ).

Получ сыв: обычно сыв получ путем иммунизация животных, после кот контролируют титр АТ у животных и в период их наибольшего содерж у них берут кровь, выделяют плазму, удаляют фибрин – получ сыв.

Получ сыв из культивируемых животн кл (проблемы – обеспеч стаб роста жив кл) 1. Нужные нам клетки д преобладать в культуре, д быстро адаптироваться к нов усл и быстро расти. Д б полная стер-ность, стер пит ср, Н2О дист. 2. Если кл будут расти in vitro, то они теряют способность к дифференциации, дегенирируют, трансформируются. Норм жив кл растут только на поверхности, т.к. субстрат-зависимые кл, сонослойная культура. Кл растут в стороны до закрытия поверхности. Рост клеток м б достигнут за счет увелич средн массы, за счет увелич числа клеток.

Антисыворотки АС (леч, профилакт, диагност)

По специфичности разл: моновалентную АС, поли- АС, антицельную АС (против всех сывороточных белков) Недостатки АС .:

- Выделенная из крови сыворотка, сколько бы ее не очищали и ни концентрировали, сод набор разл АТ. Поэтому ее наз поликлональной. Лишь  небол часть АТ направлена против специф антигенных детерминант

- Иммуноглобулины АС уже с открытыми углеводными компонентами, поэтому быстрее выводятся из орг-ма

- Углеводные компоненты, переплетаясь м/у собой, приводят к спонтанной агрегации белков при длит хранении, что способств в кровотоке закупорке некот кол-ва капилляров и активации системы комплемента по альтернативному пути.

- Еще один серьезный недостаток: для получения АТ каждый раз необх-мо заново

иммунизироватьживотных и очищ выделенную сыворотку. Это стоит немалых денег.

Получение  АТ -содх препаратов I. От иммунизир животных

II. Из крови иммунных лиц (недавно выздоровевших)

Иммунизация жив+кровь→ретракция сгустка (40 мин, 37,5 С) →сыворотка (=АС)

Билет № 35. Представьте перспективы исп-я феромонов как биологически активных препаратов:

Феромоны (приносить, управлять)-сигнальнокоммуникативные мо-лекулы, кот распростран в возд-хе, на воде; они передают сигналы от одного организма к другому (в надорганизационных с-мах/структурах).

1)поведенческие-меняют поведение реципиента

2)влияющие на развитие реципиента

Феромоны-ремизеры-вызывают немедленный поведенческий эффект, направляют сигнал тревоги.

Феромоны-праймеры-вызыв длительный физиологический эффект в воспринимаемом организме, напр в-ва регулирующие особи насекомых к опр-ой касте.

Классификация:

1)взаимод-е между видами животных:

-анеомоны-дают выгоду донору, т е тому кто выбирает феромоны

-кайромоны-дают выгоду тому кто их воспринимает

Практическое исп-е феромонов:

как ловушки-вместо инсектицидов и ядохимикатов

микроорганизмы также выделяют феромоны, например при процессе конъюгирования (когда идет сближение донора и реципиента), если заингибировать этот процесс, то можно уменьшить конъюгацию (это важно при госпитальной инфекции).

Билет № 28.

Источник штаммов болгарская палочка, выделенная из простокваши.Важнейшим компонентом пробиот. явл-я молочнокислые бактерии-лактобациллы,бифидумбактерии,энтерококки.Сейчас

всё чаще применяют лечпродукты и пр-ты на основе молочнокислых бактерий-симбионтов.В повседн-ое потребление широко входят кисломолочные продукты(кефир,йогурт,мацун и др),содерж-ие эти микроорганмы.Виды пр-тов:колибактерин создан на основе штамма кишечной палочки.Это непатогенный штамм,способный продуцировать бактериоцины;бифидумбактерин-готовится на основе штамма ЛВА-3 бифидумбактерин Бифидум;лактобактерин соДержит живые кл-ки лактоБацилл.Процесс получения Пробиотиков включ этапы культивирования бактерий на специально разработанных средах,отделения их биомассы,смешивания концентрата бактерий с наполнителями и добавками.В практике здравоохранения обычно используют сухие монопрепараты,напр.бификол

Билет № 26. Рассмотрите вклад биот-гии в решение эколог проблем с т. з. возм-й сочетания генной инженерии с инженерной энзимологией

Биотехнологические аспекты фарм произ-ва:

Б/кое произ-во наукоемко и высоко эффективно, поэтому кол-во отходов не велико; мала расход-ся прир ресурсов, процесс мало энергоемкий. Этапы б/т процесса: подготовит операции, биосинтез в ферментере, выделение и очистка в-ва.

Направления совершенствования б/т произ-ва: 1)соверш-вание биосинтеза в ферментере приведет к уменьшению потребл энергии, ↓выброса вредн в-в. Это дотиг-ся выбором продуцента. 2)замена дифиц ср-в на недифици, исп-е недиф реактивов. 3)работа с иммобил биообъектами. 4) совершенствован выделения и очистки: ↓кол-ва исп-емых орг р-лей и введение мембранной технологии, собл правил GMP. Идеал-безотходное пр-во, на практике невозмож.

Проблема б/т в экол плане:

1)уничт тв отходов. При отдел мицеллия ф-ем получ сотни тонн мицеллия в год, в нем имеются остатки целевого продукта. Сейчас: мицелий подсуш и отвозят на свалки (примитивн путь); помещ мицел в грунтов ямы на бетон пол, перемеш с почв и оставл на неск лет-почвен м-мы перераб мицел (удобно); Более прогрес пути утилиз: мицел можно стерилизовать и доб в корм с/х животн (у нас не исп); можно доб в строит материалы-↑их прочность.

2)очистка жидк отходов (культур ж-ти): 1 этап.

Культуральн жидкость подается в 1-й отстойник

с отсосом, кот удаляет ос-к.

2 этап. Ж-ть подается в аэротенк-больш железобетон бассейн, на дне кот уложены трубы, по кот непрерывн подается возд. Созд-ся сообщество «активный ил». Представ рода Pseudomonas. 3 этап. Во втором отстойнике осажд активн ила. 4 этап. Далее подаются на биофильтры-пленки, распол перпендик току ж-ти, в кот вмонтированны штаммы-деструкторы, получ генн инженер, они насыщ плазмидами и окисл ферментами. 5 этап. Хлорирование.

3)ликвидация газообр отходов. Произ-ся на колонках с катализатором при Т 3000С-сжигание до СО2.

Билет № 21. Докажите существенность гена-мишени при поиске новых ЛС:

Гены могут разделяться на: 1) гены на кот держится «дом»-house keeping; 2) рабочие гены, работают только в органе ivi; 3) гены вирулентности. Продукты этих геновпозвол проникать м-мам в кл. Прикрепл на кл гена позвол перенести дефицит пит в-в. Выделен таких генов-сист IVET. Экспиримент: из патог штамма сальмонеллы выделена хромосома. В ней 3-4 тыс генов. Спомощ рестриктазных хромосом делят на фрагменты. Отбир рестрикты, сод-щие ivi-гены. Также сущ рестрикт X. К нему прис 2 послед гена. Хлорамфеникол-ацетилтрансфераза (САТ)-от него отрезают промоторную часть, затем присоед гены, дающие белки и окисляющие лактозу. Промоторы также отрезают, в рез-те получают: рестриктаза X-САТ-lac Z. След стадия-эту констр-цию встраиваем в плазмиду, а ее в кл E. Coli;

инкуб период 24ч

мышь → из мыши берут X и сеют

Если E. Coli выжила то САТ не подействовал, след ген X экспрессировался в животном. Суспензию кл высевают на тв агар, среду с Ind, рН, лактозой и ч/з 24 ч выросли розовые колонии-работал lac-оперон, работ гены house keeping. Если выросли белые колонии, где lac-оперон не работал. Работали гены ivi.

Билет №41. Ваши представления о иммуноглобулине человека

Молекула иммуноглобулина человека содержит две идентичных легких и две идентичных тяжелых цепи. Тяжелые полипептидные цепи имеют 5 структурных вариантов, которым соответствует 5 структурно и функционально различных классов иммуноглобулинов: IgG, IgA, IgM, IgD, IgE. При обработке Ig протеиназами, в частности папаином, получаются 3 больших фрагмента. Два из них идентичны и обозначаются как Fab (Fragment antigen binding — фрагмент, связывающий антиген). Третий фрагмент обозначается как Fc (Fragment crystalline — фрагмент кристаллический). Fc фрагмент обуславливает различные эффекторные функции антител, не имеющие отношения к их специфичности, связывание компонентов комплемента, взаимодействие с Fc рецептором макрофагов и др.

К IgG относятся разнообразные антитела против бактерий, их токсинов и вирусов. IgG содержится не только в сосудистом русле, но легко проникает в экстраваскулярные пространства. Это единственный класс Ig, проникающий через плаценту и обеспечивающий иммунную защиту новорожденного.

IgM является пентамером, т.е. содержит 5 четырехцепочечных структур. Каждая молекула IgM имеет 10 Fab фрагментов, способных к специфическому взаимодействию с антигеном и обладающих высокой антигенсвязывающей активностью, которая проявляется только в случае интактной молекулы. Антитела, относящиеся к IgM, появляются в сосудистом русле на ранних стадиях иммунного ответа, выполняя защитную функцию в начальной фазе развития инфекционного воспаления.IgA содержится как в сыворотке крови (около 50% от общего содержания IgA в организме), так и в различных секретах, что обеспечивает защиту слизистых оболочек от патогенных микроорганизмов. В отличие от IgG и IgM, антитела IgA класса не активируют комплемент и не вызывают выделения медиаторов воспаления.

Фармакологическое действие препаратов Ig у пациентов, у которых имеет место дефицит антител, определяется наличием в препаратах иммуноглобулинов антител, направленных против определенных бактерий или вирусов. В ряде препаратов иммуноглобулинов имеется широкий спектр антител, что зависит от величины пула плазмы, используемого для выделения Ig. Обычно используют пул от 1000 и более здоровых доноров. Таким образом Ig, выделенный из пула плазмы здоровых доноров, содержит антитела, встречающиеся в норме в донорском контингенте. Некоторые препараты иммуноглобулинов содержат антитела одной специфичности (например, против CMV). Фармакологическое действие препаратов Ig при аутоиммунных заболеваниях находится в стадии изучения. Предполагается несколько механизмов, среди них блокада функции Fc рецептора фагоцитирующих клеток, торможение продукции или нейтрализации аутоантител антиидиотипическими антителами, влияние на функцию Т клеток, продукцию и активность цитокинов.

Ig представл собой белки человека (жив), явл-ся носителями актив-ти АТ и присутствуют в крови, церебр жид, селезенке и др. Синтезируются в лимфоидных кл. Билогич роль в орг-ме связана с участием в процессе иммунитета. Ig назыв очищенные и концентрированные препараты гамма-глобулиновые фракции сывороточных белков, содержащие высокие титры АТ. Освобождение от балластных сыв белков способствует ↓ токсичн, обеспеч быстрое направленное и прочн связыв-е с АГ. Современ технологии получ человеч Ig гарантир гибель вируса гепатита. Сыв вводят различ путями: п/к, в/м, в/в. Пассив иммунитет возник ч/з неск часов и длит до 2-х недель. Гомологичные сыв или гамма-глобулины чел-ка ввод однократно. Чел гамма-глоб для профил кори в/м 1,5-3мл

Иммуноглобулин человеческий нормальный – иммуностимул, ↑ содерж АТ в орг-ме. Примен в кач-ве заместительной терап с целью профил инф при синдромах первичного или вторичного иммунодефицита (СПИД). Взаимодействие:↓ эффект-сть актив иммунизации (жив вирусн вакц для перент введ не следует исп 30 дней после введения Ig).

В зависимости от технологии получения и свойств, препараты Ig делятся на препараты первого поколения — химически или энзиматически модифицированные Ig; второго — интактные лиофилизированные препараты; третьего — интактные жидкие препараты; четвертого — интактные жидкие, в технологии получения которых использованы высокоэффективные методы инактивации вирусов.

Препараты Ig для в/м введения используются в клинической практике реже, чем препараты Ig для в/в введения. Они в основном содержат высокие титры антител к одному определенному возбудителю: стафилококку, возбудителю столбняка, вирусу клещевого энцефалита, вирусу бешенства, цитомегаловирусу. После в/м введения в месте инъекции деградирует около 60% Ig.

Препарат следует хр при комн t, не выше 25ºС, в защищ от сета месте, не рекоменд замораживать.

Билет №42. Ваши представления о значении гибридомной технологии в биотехнологии:

Иммунобиотехнология – раздел биотехнологии, включающий научную разработку, создание технологии производства профилактических, диагностических и лекарственных средств с использованием в качестве действующего начала регуляторов и эффекторов иммунной системы.

В иммуном ответе приним участ значит число медиаторов, изучение кот было бы невозможно без высокочувств м-дов их опред-я, основ на моноклональных АТ. Масшатабн произ-во монокл АТ стало возможно после того, как Келлер и Мильштейн предлож м-д гибридомной технологии. Они использ м-д гибрид сомат клеток. Слили лимф-ты от иммунизированной АГ мыши с сингенной опухол кл перевиваемой плазмоцитомы, получив жизнеспособн гибридные кл, кот неогранич делились и продуцировали специф АТ. Опухоли – гибридомы, а АТ – моноклональные АТ (созд 1 клоном гибрид кл). Монокл АТ в иммунохим анализе позвол диагност многие инф и неинф заб-я, проводить опред групп крови. Области применения моноклональных антител: ДИАГНОСТИКА (иммунохим-е анализы биолог жидкостей и клеток орг-ма, вирусов, микроорг-в; иммуногистохимические методы, иммуносцинтиграфия опухолей, типировние групп крови и тканей) ТЕРАПИЯ (возд-е на определ-е клеточн популяции; влияние на иммунные регулят-е мех-мы с помощью АТ к лимфокинам; иммунорегул-я с помощью антидиотипич-х АТ; направленный транспорт лекарств с помощью моноклональных АТ; элиминация токсинов, Ig E и аллергенспециф-х IgE антител.) ТЕХНОЛОГИЯ (идентифик-я молекул, очистка молекул и Кл-к, несущих специфический АГ), НАУЧНЫЕ ИССЛНДОВАНИЯ (исследование этиологии и патогенеза различных заболеваний, исследование систем-х и межсист-х мех-в регуляции; создание новых ЛС и биопрепаратов)

Уникальная специфичность моноклон-х АТ позволила выявить генетическ-е вар-ты многих маркеров, что создает возможность изучать генетические механизмы многих заболеваний. Применение моноклон-х АТ в терапии должно быть ограничено, т.к. продукты гибридом могут быть контаминированы генетическим матер-м ретровирусов.

В гинекологии успешно примен экспресс-метод опред беремен по уровню хорионического гонадотропина в моче.

Получение моноклональных АТ : синтетическим конъюгированным антигеном иммунизируют мышей. Лимфоциты из селезенки мыши сливают с помощью полиэтиленгликоля с клетками стабильной миеломной линии. Из образующихся гибридных клеток отбирают только те, которые унаследовали от влеток селезенки способность продуцировать АТ к лекарству, а от миеломных клеток – способность неограниченно расти в культуре и быть практически бессметрными. После соотв-го культивирования получают клон клеток, продуц-х антитела к ЛП, который можно выращивать на мышах в виде асцитных опухолей. Затем из асцитной жидкости выделяют антитела.

Принцип иммуноан-за: заданное кол-во АТ конкурентно взаимод-т со смесью неизвестного кол-ва измеряемого вещ-ва и постоян-го кол-ва этого же вещ-ва, связанного с какой либо меткой. После завершения иммунохим-й реакции измеряют количество метки, связанной с АТ. Очевидно, что чем больше немеченого вещества будет добавлено в сис-му, тем меньше кол-во метки окажется связанным с АТ. Используя известные кол-ва немечен-го вещ-ва, строят калибровочный график, по кот-му можно затем определять конц-ю лек-ва в анализ-й пробе. В качестве метки используют ферменты, флуоресцентные красители. Сущ-т 2 подхода к разработке иммунохим-х методов: гетерогенный – с разделением компонентов после проведения иммуннохим-й р-и и гомогенный – без разделения компонентов. В первом методе фермент играет роль пассивного маркера, так как его активность не измен-ся в ходе р-и. второй подход заключается в построении такой сис-мы анал-за, при кот-й актив-ть ферментнй метки изменяется в ходе иммунной реакции.

Билет №44. Ваши представления о значении гибридомной технологии в биотехнологии:

Иммунобиотехнология – раздел биотехнологии, включающий научную разработку, создание технологии производства профилактических, диагностических и лекарственных средств с использованием в качестве действующего начала регуляторов и эффекторов иммунной системы.

В иммуном ответе приним участ значит число медиаторов, изучение кот было бы невозможно без высокочувств м-дов их опред-я, основ на моноклональных АТ. Масшатабн произ-во монокл АТ стало возможно после того, как Келлер и Мильштейн предлож м-д гибридомной технологии. Они использ м-д гибрид сомат клеток. Слили лимф-ты от иммунизированной АГ мыши с сингенной опухол кл перевиваемой плазмоцитомы, получив жизнеспособн гибридные кл, кот неогранич делились и продуцировали специф АТ. Опухоли – гибридомы, а АТ – моноклональные АТ (созд 1 клоном гибрид кл). Монокл АТ в иммунохим анализе позвол диагност многие инф и неинф заб-я, проводить опред групп крови. Области применения моноклональных антител: ДИАГНОСТИКА (иммунохим-е анализы биолог жидкостей и клеток орг-ма, вирусов, микроорг-в; иммуногистохимические методы, иммуносцинтиграфия опухолей, типировние групп крови и тканей) ТЕРАПИЯ (возд-е на определ-е клеточн популяции; влияние на иммунные регулят-е мех-мы с помощью АТ к лимфокинам; иммунорегул-я с помощью антидиотипич-х АТ; направленный транспорт лекарств с помощью моноклональных АТ; элиминация токсинов, Ig E и аллергенспециф-х IgE антител.) ТЕХНОЛОГИЯ (идентифик-я молекул, очистка молекул и Кл-к, несущих специфический АГ), НАУЧНЫЕ ИССЛНДОВАНИЯ (исследование этиологии и патогенеза различных заболеваний, исследование систем-х и межсист-х мех-в регуляции; создание новых ЛС и биопрепаратов)

Уникальная специфичность моноклон-х АТ позволила выявить генетическ-е вар-ты многих маркеров, что создает возможность изучать генетические механизмы многих заболеваний. Применение моноклон-х АТ в терапии должно быть ограничено, т.к. продукты гибридом могут быть контаминированы генетическим матер-м ретровирусов.

В гинекологии успешно примен экспресс-метод опред беремен по уровню хорионического гонадотропина в моче.

Получение моноклональных АТ : синтетическим конъюгированным антигеном иммунизируют мышей. Лимфоциты из селезенки мыши сливают с помощью полиэтиленгликоля с клетками стабильной миеломной линии. Из образующихся гибридных клеток отбирают только те, которые унаследовали от влеток селезенки способность продуцировать АТ к лекарству, а от миеломных клеток – способность неограниченно расти в культуре и быть практически бессметрными. После соотв-го культивирования получают клон клеток, продуц-х антитела к ЛП, который можно выращивать на мышах в виде асцитных опухолей. Затем из асцитной жидкости выделяют антитела.

Принцип иммуноан-за: заданное кол-во АТ конкурентно взаимод-т со смесью неизвестного кол-ва измеряемого вещ-ва и постоян-го кол-ва этого же вещ-ва, связанного с какой либо меткой. После завершения иммунохим-й реакции измеряют количество метки, связанной с АТ. Очевидно, что чем больше немеченого вещества будет добавлено в сис-му, тем меньше кол-во метки окажется связанным с АТ. Используя известные кол-ва немечен-го вещ-ва, строят калибровочный график, по кот-му можно затем определять конц-ю лек-ва в анализ-й пробе. В качестве метки используют ферменты, флуоресцентные красители. Сущ-т 2 подхода к разработке иммунохим-х методов: гетерогенный – с разделением компонентов после проведения иммуннохим-й р-и и гомогенный – без разделения компонентов. В первом методе фермент играет роль пассивного маркера, так как его активность не измен-ся в ходе р-и. второй подход заключается в построении такой сис-мы анал-за, при кот-й актив-ть ферментнй метки изменяется в ходе иммунной реакции.

Билет №45. Представьте преимущества рекомбинантного инсулина по качеству перед инсулином животного происхождения:

Инсулин-пептид-й гормон, регулирующий углеводный обмен и поддержив-й уровень сахара в крови; состоит из 2-х пептидных цепей – А (содерж 21 АК-остаток) и В (содержащий 30 АК остатков) – связанных между собой 2-мя дисульфидными S-S связями между остатками цистеина: А0цепь имеет дополнительную внутреннюю S-S связь. Инсулин можно получать из животного сырья (на 1 кг инсулина требуется 35000 свиных голов). Также к недостаткам относят: проблемы хранения, транспортировки, а также осложнения аллергического хар-ра. (АК-й состав свиного, бычьего и челов-го инсулина и проинсулина несколько различен); нечеловеческий проинсулин, от кот-го нельзя полностью избавиться – является для орг-ма чужеродным белком.

В настоящее время стало возможно производить инсулин человеческий биосинтет-м методом с использованием рекомбинантных ДНК in vitro. Суть дела составляет встраивание природной или чужеродной ДНК в бактериальную плазмиду – получаем рекомбин-ю молекулу ДНК, кот-ю далее вводят в клетку –хозяина. Жизнеспособные кл-ки, содержащие такую ДНК, размножаются. В итоге удается селекционировать клоны трансформированных кл-к, способных к образованию специф-х белков в больших количествах. Рекомбинантная плазмида содержит последоват-ть нуклеотидов, кодирующую А- и В- цепи инсулина и соедин-й их пептид С, сигнальный (лидерный) участок, а также, промотор. Участок промотора при определ-х услов-х в рез-те индукции запускает синтез рекомб-го белка. Лидерный участок нужен для придания необходимых св-в целевому продукту.

Другой путь биосинтеза инсулина – раздельный биосинтез А- и В- цепей. Методика: используется штамм-продуцент Е. Coly JM-109. конструкция плазмиды обеспечивает синтез рекомб-го белка, представ-го собой лидерную последовательность и фрагмент белка А (специф-й белок Staphilococcus aureus) и последоват-ть проинсулине человека, а между ними находится остаток АК метионина, разруш-ся под д-м галогенцианов. Этим свойством удобно воспользоваться для последущего отщепления проинсулиновой части молекулы. Кроме того плазмида содержит ген устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, поэтому при культивировании биомассы добавляют антибиотики, подавл-е рост посторон-х микроорг-в, в том числе и кл-к E. Coly, потеряв-х плазмиду. Ферментация E. Coly занимает короткий период – 12 часов. Далее с помощью центрифуги и дезентегрированию получают внутрикл-й рекомб-й белок. Дезентеграторы6 механические, ультразвук-е, гидравлические. Полученный раствор рекомб-го белка отделяют от примесей ионообменной хроматорафией на неподвижной матрице., далее исп-т гель-фильтрацию для обессоливания. Далее сушат в вакууме или на лиофильной сушке. Далее проводят хим гидролиз (получают структурный аналог проинсулина), сульфитолиз (получ. Проинсулин S-сульфонат), ренатурацию (получ проинсулин в нативной форме), ферментативный гидролиз (получ инсулин) готовый продукт исследуют методами высокоэф-й хроматографии и электрофореза. Существуютт отдельные фармакопейные статьи, имеющие соотв-е требования: чистота, активность, апирогенность.

Радиоимунный анализ – метод гетерогенного исследования. Используются изотопы. В гетерогенных исследованиях важно полное разделение и свободное связывание АГ. Всплывающее (свободная фракция) загрязнение преципитата (связанная фракция) будет увеличивать кол-во связанной фракции в минуту и давать ошибочно низкие результаты концентрации АГ. РИА очень чувствителен - благодаря радиоактивности, которая может быть измерена в малых кол-х и относительно свободна от матричных эф-в. есть 2 общих метода для исправления разделения – это технология удвоенных АТ и покрытой трубки. В первом методе добавл АТ (назыв. Втор-м АТ), которое связано с перв-м АТ, и перв-е АТ осаждает комплекс АТ2-АГ (использование двух различных АТ в одном тесте делает идею исследований сложной в объяснении, но технология работает очень хорошо) полиэтиленгликоль, помещенный в один из реагентов, часто добавл-ся для дальнейшего полного осаждения. Во втором методе, первичное АТ связывается с внутренней стороной трубки, позволяя аналитику очистить от всплывающих вещ-в, чтобы убрать свободный меченый АГ. Трубка помещается в гамма-счетчик для определения связанной фракции.

Билет № 38. Определите роль иммуноглобулинов (АТ), учитывая:

АТ – специф соед образ-ся при р-ции орг-ма на внедрение АГ АТ=Ig. Они представл собой гликопротеины с М 150000- 1 млн. Ig состоит из 4-х цепей: 2-х одинак тяжелых цепей (Н) и легких (L). Каждая цепь в свою очередь сост из доменов, соедин-х дисульфидными мостиками.

Выдел 5 классов Ig: 1. Ig G преобл в плазме крови, активируют сис-му комплемента. 2. Ig М – самые крупн АТ, нейтрализуют инородн ч-цы, вызывают агглютинацию клеток. 3. Ig A сод в слюне и секретах ЖКТ, отвеч за местн защитн реакцию. 4. и 5. Ig D и Ig Е присутствуют в плазме в очень малых кол-вах.

АГ + АТ = АГ-АТ Взаимодействие актив центра АТ с АГ-детерминантой (участок молекулы АГ, связывающийся с актив уентром АТ, сост из 4-8 аминокислот)

Билет №19. Приведите хар-ку β-лактамов и их особенностей в отношении:

β-лакт а/б обр-ся 2-мя родами плесн грибов: Penicillium, Cephalosporium. Β-лакт а/б ПЦ и ЦС. Обязат и важн часть их молек от кот завис антимикр активн-весьма реакционноспособное β-лакт кольцо. Плесн гр (продуценты) - отс плодового тела, эукариоты, имеют ядро, митохондрии.

М-м д-я β-лакт а/б: ингибир синтез пептидокликана кл стенки на посл этапе, подавляя акт фермента транспептидазы. Транспептидазы соедин концы пептидных цепочек, на концах кот нх Д-аланин. Β-лакт а/б явл аналогом Д-аланина- пептидн цепочки не замыкаются.

Β-лакт кольцо в мол а/б, подав-х активность транспептидаз и Д,Д-карбоксипептидаз, имеет сход с одной из стереоформ, кот принимает попавший в активн центр свободн конец пептидн цепочек. Попав в акт центр функ-мишеней β-лакт а/б связыв с функ, ацетилируя одну из гидроксильн групп в акт центре. Бактер кл содерж неск разл по молек массе транспептидаз. Сродство у разл β-лакт мол-л к разн транспептидазам, получившим названия ПЦ связывающие белки-ПБС-1,2,3 неодинаково, поэтому фактически неодинаков и мех-м д-я разл β-лактамов. Все это сказыв на лечебн св-ах β-лак а/б.

Билет № 27. Охарактер препараты на основе живых культур м-мов-симбионтов (нормофлоры и пробиотики) по показателям:

"Пробиотики" в современном понимании - это бактерийные препараты из живых микробных культур, предназначенные для коррекции микрофлоры хозяина и лечения ряда заболеваний. Основоположником концепции пробиотиков является И.И. Мечников Фундаментальные исследования современной биологической и медицинской науки позволили разработать и внедрить в практику многие пробиотики, основу которых составляют живые микробные культуры.Пробиотики, в отличие от антибиотиков, не оказывают отрицательного воздействия на нормальную микрофлору,поэтому их широко применяют для профилактики и лечения дисбактериозов. В то же время эти биопрепараты характеризуются выраженным клиническим эффектом при лечении (долечивании)ряда острых кишечных инфекций. Важной особенностью пробиотиков является их способность повышать противоинфекционную устойчивость организма,оказывать в ряде случаев противоаллергенное действие, регулировать и стимулировать пищеварение.В настоящее время в медицине уже широко используют лактобактерин, бифидумбактерин, колибактерин,бификол, ацилакт и другие.Тем не менее, во всем мире продолжается огромная работа по созданию новых более активных пробиотиков. Важным арсеналом совершенствования биопрепаратов являются бактерии рода Bacillus.Пробиотики обладают регулирующим влиянием на продукцию цитокинов,функциональную активность фагоцитирующих клеток, NK-лимфоцитов,стимулируют синтез иммуноглобулинов. В качестве лечебно-профилактического средства пробиотики хорошо зарекомендовали себя при лечении заболе ваний, в патогенезе которых определенную роль играет нарушение защитной функции слизистых оболочек:острые и хронические заболевания ЖКТ, бактериальные вагинозы, респираторные инфекции. Весьма обнадеживают результаты использования пробиотиков профилактики и лечения атопического дерматита,а также язвенного колита.Таким образом, включение пробиотиков в комплекс лечебных мероприятий при острых и хронических воспалительных процессах может рассматриваться как патогенетически обоснованное перспективное направление, требующее дальнейшего развития.

Билет № 24. Представьте роль витаминов и их производных в составе фарм-ческих ЛП, если вам известно:

Вит-это группы орг НМС разл хим природы, оказывающие в очень низких дозах разл биол д-е. В орг-ме чел-ка и животных вит не синтезир-ся или синт в небольш кол-вах и поступ в основном с пищей. Осн источ вит растения. Некотор вит явл продуктами жизнедеят-ти микрофлоры киш-ка. Высок биол активн облад их произ-ые-коферменты. Способы получения: 1)выделен из прир соедин; 2) хим синтез; 3) микроб синтез. Преимущ-ва: простое сырье, оборудование, отсут вредных выбросов, возм получ прод-та в 1 стадию.

В12-цианокобаламин: продуценты-прокариоты-мутанты штамма propionibacterium и pseudomonas анаэробно на жидк пит средах с солями Со, кукур экстракт, глюк, сульфат аммония. Ферментацию осущ-ют в течен суток, затем вносят в среду 5,6-диметилбензимидазол. Извлечен получ из биомассы с пом хромат и перекристаллизации.

В2-рибофлавин: продуцент- дрожжи и дрожжеподобные грибы, обр-щие свободн В2 и его коферм ф-мы ФМН, ФАД. Исп Eremothecium ashbyii и Ashbya gossipii

Пантотеновая к-та: синтез осущ с помощ иммобилиз-х кл бактерий

Аскорбиновая к-та: получ химико-энзиматич способом 1)восстан Д-глюк в Д-сорбент (хим пр) 2)Д-сорбент окисл в α-сорбозу с помощ Acetobacter suboxydans 3)α-сорбоза→α-аск к-та.

РР-ник к-та: произ-во на культивировании биопродуцентов. Сущ биотехн способы получ коферментов – никотинамидадениндинук-леотида из дрожжей, путем культивир на средах с предшествен-никами.