18. Принципы и метод окраски по Цилю-Нильсену.

Кислотоустойчивые бактерии, из-за наличия в их кл липидов, восков и оксикислот, после окраски их р-ром фуксина Циля при нагревании прочно связывают фуксин, прокрашиваются в красный цвет и не обесцвечиваются кислотным р-ром спирта. Все остальные окрашенные микроорганизмы обесцвечиваются и дополнительно окрашиваются р-ром метиленового

синего в синий цвет.

ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА 1. На фиксированный мазок наложить кусочек фильтровальной бумаги по размер препарата. Нанести небольшой избыток раствор фуксина Циля. 2. Внести предметное стекло с препаратом в небольшое пламя горелки и греть до появления паров. Стекло вынуть из пламени и дать слегка остыть. 3. Процедуру по Пункту 2. повторить еще 2 раза. Важно, процедуру прогрева проводить так, чтобы к концу 3 раза фильтровальная бумага оставалась влажной!

4. Подогретый мазок оставить остывать на 5 минут для более полного окрашивания клеточной системы бактерий. 5. Снять фильтровальную бумагу и осторожно с обратной стороны стекла промыть водой до полного окончания отхождения фуксина. 6. Мазок поместить в солянокислый спирт или налить на поверхность стекла для обесцвечивания. Обесцвечивать до полного удаление краски (около 3 минут). Тщательно промыть дистил водой. 7. Докрасить препарат путем нанесения на препарат р-ра метиленового синего. Важно не перекрасить! Время окраски может занимать от 30 секунд до 1 минуты. 8. Стекло с препаратом промыть дистиллированной водой.

9. Высушить на открытом воздухе при комнатной Т. Микроскопировать под масляной иммерсией.

19. Структурные элементы бактериальной кл. Какие из них зависят от условий существования бак.

Обязательными структурными элементами бактерий явл: цитоплазма с нуклеоидом и рибосомами, цитоплазматическая мембрана (ЦПМ), клеточная стенка.

Цитоплазма прокариотов в отличие от эукариотов не содержит митохондрий и хлоропластов, аппарата Гольджи, лизосом, эндоплазматической сети. Нуклеоид выполняет в кл бак ф-цию ядра, т.е. явл носителем генетической информации, однако, в отличие от ядра эукариотической кл, он не имеет ядерной мембраны, не делится митозом. Нуклеоид состоит из замкнутой в кольцо нити ДНК. В генетическом отношении ДНК нуклеоида явл единственной бактериальной хромосомой. В связи с этим бактерии имеют гаплоидный набор генов, контролирующих все их жизненно важные функции. Органеллы цитоплазмы выявляются при электронной микроскопии.

Цитоплазматическая мембрана ограничивает снаружи цитоплазму и состоит из тонкого слоя фосфолипидов и белка. Ф-ции ЦПМ: получение энергии в результате биологического окисления, участие в питании посредством активного транспорта в-в, участие в биосинтезе в-в, делении кл. В состав ЦПМ входят окислительные ферменты, пермеазы, различные биосинтетические ферменты. ЦПМ выявляют при электронной микроскопии.

Клет стенка у Гр+ бактерии, как правило, содержит многослойный пептидокликан, кот придает клет стенке прочность. Клет стенка определяет форму бактерий, служит для механической защиты, участвует в питании за счет диффузии и осмоса. У Гр- бактерий клет стенка представлена тонким слоем пептидогликана, покрытого наружной мембраной, в состав кот входят белки, фосфолипиды и липополисахариды (ЛПС). Наруж мембрана клет стенки патогенных микробов во многом определяет специфичность их взаимодействия с орг хозяина и помогает в распознавании близкородственных микробов. По компонентам и структуре клет стенки, биохим механизмам ее синтеза бактерии коренным образом отличаются от животных и растений. Поэтому л п, специфически воздействующие, напр, на бактериальные стенки, безвредны для высших организмов. Клет стенку бак выявляют при электронной микроскопии, специальным окрашиванием или в опыте плазмолиза.

Необязательные (непостоянные) структур элементы: капсулу, спору, включения, жгутики, пили.

Капсула предст собой поверхностно расположенное слиз образование, кот по хим природе чаще явл полисахаридом. Капсула выполняет защитную ф-цию, предохраняя кл во внеш среде от высыхания и др неблагоприятных ф-ров, а в орг хозяина - от фагоцитоза, бактериолизиса и др р-ций, л п. Бак, образующие капсулу в организме и на пит средах, называют капсульными (напр, клебсиеллы пневмонии). Некот бак образуют макрокапсулу только в организме (золотистый стафилококк, стрептококк пневмонии, палочка сибирской язвы, возбуд чумы, туляремии). Многие бак образуют микрокапсулу: возбуд коклюша, патогенные энтеробактерии и др. Капсулу выявл мет. Бурри-Гинса.

Споры явл формой существования, предназначенной для сохр бактерий во внеш среде. В 1ой бактериальной кл в течение 12-18 часов формируется 1 спора, кот при благоприятных условиях за 4-6 часов прорастает в 1 вегетативную кл. Спорообразующими явл, как правило, Гр+ палочковидные бактерии: те, у кот диаметр споры не превышает поперечный размер кл, называют бациллами, те, у кот диаметр больше - клостридиями. Устойчивость спор к неблагоприятным физико-химическим воздействиям связана с наличием многослойной оболочки, повышенным содержанием липидов, ионов кальция, магния, вода в связанном состоянии. Жизнеспособность спор при обычных условиях может сохраняться в течение десятилетий и столетий. Для уничтожения спор применяют методы стерилизации (пар под давлением, горячий воздух и др.). Споры окрашиваются плохо. Для выявления используют сложные методы окраски (по Циль-Нильсону, Ожешке и др.)

Включения. В кл прокариотов можно обнаружить включения (скопления полисахаридов, липидов, полифосфатов, серы). У дифтерийной палочки и некот др бактерий в цитоплазме обнаруживаются зёрна волютина (полифосфаты), выполняющие ф-цию запасного в-ва (источника фосфора и энергии). Включения и цитоплазма по-разному окрашиваются одними и теми же красителями. Напр, при окраске уксусно-кислым генцианвиолетом цитоплазма у дифтерийной палочки окрашивается в бледно-фиолетовый цвет, а расположенные по полюсам зерна волютина - в темно-фиолетовый. Обнаружение зёрен волютина имеет диагностическое значение.

Жгутики - явл поверхностными придатками бактериальной кл, состоят из белка флагеллина и выполняет ф-цию движения. Наиб подвижны микробы с 1 жгутиком - монотрихи (холерный вибрион) менее подвижны микробы с пучком жгутиков на одном из полюсов –лофотрихи (синегнойная палочка) или имеющие жгутики на обоих полюсах - амфитрихи; наименее подвижны перитрихи, у кот жгутики расположены по бокам или по всей поверхности (многие энтеробактерии). В световом микроскопе жгутики не видны. Для их выявления испол прямые методы: электронную микроскопию или специальное окрашивание, позволяющие увеличить размеры жгутиков, напр, за счет наслоения солей тяжелых металлов. С целью косвенного выявления жгутиков изучают подвижность микробных кл. Для этого готовят нативные препараты (раздавленная или висячая капля), кот микроскопируют в затемненном поле зрения, темнопольном или фазовоконтрастном микроскопах.

Пили также явл поверхностными придатками бактериальной кл и предст собой тончайшие нити (тоньше и короче жгутиков), состоят из белка пилина. Ф-цией пилей явл прикрепление к субстрату; они также способствуют контакту кл – донора с кл - реципиентом при конъюгации. Наличие пилей у патогенных микробов во многом опред их способность вызывать заб, т.к. они необходимы для осущ адгезии (прилипания). Прямое выявление пилей возможно только при электронной микроскопии.