11. Люминесцентная микроскопия.

Основана на явлении фотолюминесценции. Люминесценция — свечение веществ, возникающее после воздействия на них каких-либо источников энергии: световых, электронных лучей, ионизирующего излучения. Фотолюминесценция — люминесценция объекта под влиянием света. Если освещать люминесцирующий объект синим светом, то он испускает лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета. В результате возникает цветное изображение объекта. Флюоресценция – свечение микроскопических объектов, возбуждаемое поглощенной световой энергией. Для люминесцентной микроскопии необходимы источник ультрафиолетового или сине-фиолетового света и набор оптических светофильтров для отделения флюоресценции от падающего света. Микроскопические препараты обрабатывают специальными красителями – флюорохромами.

12. Фазово-контрастная микроскопия.

Фазово-контрастное приспособление дает возможность увидеть в микроскоп прозрачные объекты. Они приобретают высокую контрастность изображения, кот м б позитивной или негативной. Позитивным фазовым контрастом называют темное изображение объекта в светлом поле зрения, негативным — светлое изображение объекта на темном фоне. Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. При прохождении света через микробную клетку за счет разницы в показателях преломления структур клетки происходит изменение фазы проходящих световых лучей. Фазово-контрастное устройство позволяет оптическим путем превращать различия по фазе в изменение амплитуды света, в результате чего живые прозрачные объекты становятся контрастными, хорошо видимыми глазом.

13. Электронная микроскопия.

Позволяет наблюдать объекты, размеры кот лежат за пределами разрешающей способности светового микроскопа (0,2 мкм). Электронный микроскоп применяется для изучения вирусов, тонкого строения различных микроорганизмов, макромолекулярных структур и других субмикроскопических объектов. В электронном микроскопе пучок света заменен потоком электронов. Длина волны электронных лучей во много раз короче длины световых лучей, что позволяет большее увеличение и рассматривать объекты, невидимые в световом микроскопе. В электронном микроскопе линзами являются электрические или магнитные поля соответствующей конфигурации. Источник электронов – катод. Исследуемый материал наносят на тонкие пленки и помещают на пути потока электронов.

14. Морфология бактерий. Место их среди микроорганизмов, основные формы, размеры.

Морфология бактерий – это раздел микробиологии, изучающий форму, размеры, строение бактерий и их взаимное расположение относительно друг друга. Размеры бактерий измеряются в мкм и колеблются от 0,1 до 10 мкм; размеры отдельных клет структур – в нм. Существуют 4 основные формы бактерий – шаровидные, палочковидные, извитые, ветвящиеся. Шаровидные бактерии – кокки (coccus – зерно) имеют правильно сферическую или эллипсовидную форму, по расположению в мазке различают: микрококки (от греч. micros – малый) распределяются в мазке беспорядочно, по 1му; диплококки (от греч. diplos – двойной ) – попарно;

• тетракокки – по 4; сарцины (от греч. sarcina – связка, тюк) – «пакетами» по 8, 16, 32 и более; стафилококки (от греч. staphyle – гроздь винограда) – в виде гроздьев винограда;

• стрептококки (от греч. streptos – цепочка) – в виде цепочки кокков.

Характер расположения в мазках зависит от особенностей деления бактериальных кл в процессе размножения и наличием капсулы. Палочковидные формы подразделяются на:

• бактерии (не образуют спор); бациллы (аэробные спорообразующие микроорганизмы);

• клостридии (спорообразующие анаэробы).

Палочки бывают короткими, длинными с закругленными и заостренными концами. По расположению в мазках выделяют: диплобактерии; стрептобактерии; располагающиеся беспорядочно.

Извитые бактерии делятся на: вибрионы – изогнутость тела не превышает четверти оборота спирали (холерный вибрион); спириллы и спирохеты – имеют по 1му или несколько оборотов (например, возбудитель сифилиса), спирохеты отличаются от спирилл подвижностью.

Нитевидные формы (ветвящиеся) – это палочки с разветвлениями на 1ом или обоих концах (например, актиномицета).

Но размеры и форма бактерий могут изменяться под влиянием окр среды (состав пит среды, ее pH, Т, лекарственные препараты и др.), а также в зависимости от возраста культуры.

15. Приготовление и окраска препаратов-мазков.

Приготовление состоит из нескольких последовательных операций: подготовка мазка, высушивание, фиксация и окраска.

1 этап. Обезжирить стекло, протерев рабочую поверхность стекла мылом, кот затем удаляют салфеткой. Для взятия бактериальной культуры: - нагревают до покраснения бактериальную петлю в пламени горелки; - берут пробирку с исследуемой культурой в левую руку так, чтобы видеть поверхность среды; вращательным движением вынимают пробку из пробирки, прижимая ее мизинцем и безымянным пальцами правой руки к ладони; - обжигают край пробирки, осторожно вводят петлю и берут исследуемый материал; - вынимают петлю, обжигают край пробирки и закрывают пробкой. - взятый материал осторожно распределяют по предметному стеклу тонким слоем, после чего бактериальную петлю стерилизуют в пламени спиртовки;

2 этап. Если микроорганизмы выращены на плотной пит среде, то на обезжиренное стекло наносят каплю физ р-ра и в нее вносят петлей небольшое количество материала, кот распределяют тонким слоем на поверхности около 2 см².

3 этап. Мазок высушивают на воздухе и фиксируют. В процессе фиксации микробные кл погибают, этим достигается безопасность работы с ними. Убитые микроорганизмы лучше воспринимают красители, чем живые. В фиксированном мазке кл прикрепляются к стеклу и не смываются при последующей обработке. - фиксация препарата: высушенные мазки подвергают термической (предметное стекло (мазком вверх) проводят несколько раз через пламя горелки) или химической (фиксирующие р-ры: формалин, спирты, глутаральдегид, жидкость Карнау, ацетон, пары осмиевой кислоты) обработке, в результате кот бакт погибают и плотно прикрепляются к поверхности стекла.

Для количественного учета, изучения морфологии, выявления спор, капсул, органоидов, включений препарат-мазок необходимо зафиксировать и окрасить.

Методы фиксации

Физический метод	Химический метод
Фиксация мазка над пламенем спиртовки в течение нескольких секунд мазком вверх	Мазок погружают в фиксатор на определенное вр. В кач-ве фиксатора испол: этанол – 10-15 мин; ацетон – 5 мин; смесь Никифорова (этанол +эфир – 1:1) – 10-15 мин и др.

Методы окраски

Простые методы (ориентировочные)	Сложные методы (дифференцирующие)
1. Применяют для изучения морфологии микроорг. 2. Окрашивают одним красителем анилинового ряда (основным или кислым): кислый фуксин, метиленовый синий, эозин, генциановый фиолетовый.	1. Применяют для изучения структуры кл, дифференциации микроорганизмов. 2. Испол несколько красителей. Окраска по методу: Грама, Циля-Нильсена, Ожешко, Романовского-Гимза, Нейссера Гинса-Бурри.

Преимущественно для окраски микроорганизмов используют основные красители. Краситель наливают на поверхность мазка на определенное вр, затем мазок промывают до тех пор, пока струи воды не станут бесцветными, осторожно высушивают фильтровальной бумагой. Если мазок правильно окрашен и промыт, то поле зрения абсолютно прозрачно, а клетки микробов интенсивно окрашены.