16. Принцип и метод окраски по Граму в модификации Синёва.

Метод основан на способности микроорганизмов удерживать образующийся при окраске комплекс генцианового фиолетового и йода. Это связано с особенностями строения и хим состава грам+ и грам- бактерий. У грам+ бактерий на поверхности кл есть магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, кот прочно связывают комплекс генцианового фиолетового с йодом и препятствуют его вымыванию спиртом. Кроме того, грам+ бактерии имеют более выраженный пептидогликановый слой, в кот после обработки спиртом сужаются поры, что также делает невозможным вымывание красителя. В результате грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет.

У грам- бактерий отсутствуют магниевые соли рибонуклеиновой кислоты, пептидогликановый слой значительно тоньше, а размеры пор шире. Поэтому при обработке спиртом краситель легко вымывается, бактерии обесцвечиваются и при использовании дополнительного красного красителя грамотрицательные бактерии окрашиваются в красный цвет.

Методика окраски по Граму 1. На фиксированный мазок наносят карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового на 1-2 минуты, затем краситель сливают. 2. Наносят раствор Люголя на 1 мин. 3. Обесцвечивают препарат этиловым спиртом в течение 30-60 сек до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя. 4. Препарат промывают водой.

5. Мазок докрашивают водным раствором фуксина в течение 1-2 минут, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

17. Отношение бактерий к окраске по Граму. Различия между ними по строению клеточной стенки и по чувствительности к антибактериальным веществам.

Все бактерии по отношению к окраске по Граму делятся на грамположительные - темно-фиолетового цвета и грамотрицательные - красного. Способность окрашиваться в тот или иной цвет зависит от строения их клет стенки и коррелирует со многими др св-вами бактерий. У грам+ бактерий в клет стенке отсутст ароматические и серосодержащие аминокислоты, отмечается низкое содержание липидов, у грам-, напротив, эти в-ва содержатся в большом кол-ве. Кроме того, у грам+ бактерий имеется магниевая соль рибонуклеиновой к-ты, отсутствующая у грам-. Она и образует прочный хим комплекс с белком, генцианвиолетом и йодом, кот не разрушается при кратковременном действии спирта. У грам- такой комплекс не образуется. Они легко обесцвечиваются под действием спирта. Фуксин докрашивает грам- микроорганизмы в красный цвет.

Клет стенки грам+ и грам- бак резко различаются по хим составу и по ультраструктуре.

У грам+ бактерий клет стенка толще (от 20 до80 нм), чем у грам-, и пептидогликан (синонимы муреин, мукопептид) составляет основную массу ее в-ва (от 40 до 90 %). Под электронным микроскопом она выглядит как гомогенный электронно-плотный слой.

Пептидогликан представлен параллельно расположенными молекулами гликана, состоящего из остатков N-ацетилглюкозамина и N-ацетилмурамовой кислоты, соединенных гликозидной связью.

Гликановые молекулы связаны поперечной пептидной связью. Отсюда название этого полимера - пептидогликан. Основу пептидной связи составляют тетрапептиды, состоящие из чередующихся L- и D-аминокислот, напр L-аланин - D-глутаминовая кислота - мезодиами-нопимелиновая кислота - D-аланин. В пептидогликане грам+ бактерий вместо мезодиаминопимелиновой к-ты часто содержится L-диаминопимелиновая к-та или лизин. Элементы гликана (ацетилглюкозамин и ацетилмурамовая к-та) и аминокислоты тетрапептида (мезодиаминопимелиновая и D-глутаминовая к-ты, D-аланин) явл отличительной особенностью бактерии, поскольку отсутствуют у животных и человека.

В клет стенке грам+ бактерий содержится небольшое кол-во полисахаридов, липидов и белков.

Входящие в состав клет стенки полисахариды, липиды могут ковалентно связываться с ее макромолекулами в отличие от белков, кот формируют на ее внешней поверхности отдельный слой.

Т о, основными компонентами клет стенки грам+ бактерий являются 3 типа макромолекул: пептидогликаны, тейхоевые кислоты и полисахариды, кот, ковалентно связываясь, образуют сложную структуру с весьма упорядоченной пространственной организацией.

Строение клет стенки у грам- бактерий намного сложнее. У них обнаружена многослойная клет стенка. В ее состав входит гораздо большее число макромолекул разного химического типа. Пептидогликан образует только внутр слой клет стенки, неплотно прилегая к цитоплазматической мембране. Для разных видов грам- бактерий его содержание колеблется в широких пределах и существенно меньше ( 5 - 1 0 %), чем у грам+ бактерий. Хим структура пептидогликана грам- бактерий в основном сходна со структурой пептидогликана грам+ бактерий. Снаружи от пептидогликана располагается дополнительный слой клет стенки - наружная мембрана. Она состоит из фосфолипидов, типичных для элементарных мембран, белков, липопротеина и липосахарида.