Лекция № 5.

ХРОМОСОМЫ. НЕХРОМОСОМНОЕ НАСЛЕДОВАНИЕ

Организация генетического материала

• том, как организован генетический материал любой клетки, виден общий принцип. Этот материал существует в виде компактной массы в пределах ограниченного объема. При этом разнообразные активности, такие как репликация и транскрипция, должны иметь место внутри отведенного ему пространства. Организация генетического материала должна быть приспособлена к его переходам из неактивного состояния в активное состояние, и обратно.

Конденсированное состояние нуклеиновой кислоты – это результат ее взаимодействия с белками, которые, с химической точки зрения, обладают основными свойствами. Положительные заряды этих белков нейтрализуют отрицательные заряды нуклеиновой кислоты. Структура нуклеопротеинового комплекса определяется взаимодействием белков с ДНК (или РНК).

Размещение ДНК в частицах вирусов и фагов, клетках бактерий и ядрах эукариот наталкивается на общую проблему. Во всех случаях протяженность ДНК во всю ее молекулярную длину весьма и весьма превосходит размеры компартмента, в котором она содержится. ДНК (или, у некоторых вирусов, РНК) должна быть чрезвычайно плотно спрессована, чтобы поместиться в отведенное ей пространство.

Вирусный геном упакован в оболочку

Геном вируса – нуклеиновая кислота – находится внутри капсида. представляющего собой структуру, собранную из белковых субъединиц одной или двух-трех разновидностей. К капсиду прикреплены (или вмонтированы в него) другие структуры: они собраны из особых белков и необходимы для инфицирования будущего хозяина.

Вирусная частица обладает очень плотной структурой. Внутренний объем капсида редко бывает больше объема нуклеиновой кислоты, которую он должен хранить. Обычно нуклеиновая кислота занимает более половины внутреннего объема капсида, а нередко – и весь объем.

То условие, что капсид обязан быть собран из белков, кодируемых вирусом, в пределе означает, что оболочка будет целиком сконструирована из однотипных субъединиц. Геометрическая форма капсида при этом сведется к одному из двух вариантов:

• капсид нитевидной, или палочковидной, формы.

• псевдосферическая оболочка.

Существует два возможных варианта построения капсида:

• Капсид может быть собран вокруг нуклеиновой кислоты, конденсируя при этом ДНК иди РНК за счет взаимодействия белка и нуклеиновой кислоты в процессе сборки.

• Капсид может быть сконструирован как полая оболочка, которую должна заполнить нуклеиновая кислота, конденсируясь по мере своего туда вхождения

У одноцепочечных РНК-вирусов капсид собирается вокруг генома. Принцип сборки заключается в том, что положение PHК внутри капсида напрямую определяется ее связыванием с белками оболочки. Самый известный тому пример - это вирус табачной мозаики (ВТМ; tobacco mosaic virus, TMV).

Сборка сферических капсидов ДНК-вирусов происходит по-другому, подробнее всего это описано для фагов лямбда и Т4. Из небольшого набора белков собирается пустой капсид. Затем в него входит двухцепочечный геном вируса, что сопровождается изменением структуры капсида.

Разнообразные механизмы сборки вирусной частицы приводят к одному и тому же финалу: одиночной молекуле ДНК или РНК, упакованной в капсид. Впрочем, некоторые вирусы имеют геномы, состоящие из нескольких нуклеиновых кислот. Реовирус содержит десять двухцепочечных сегментов РНК. В более простом случае, у фага ф6, в капсид упаковывается три различных сегмента двухцепочечной РНК. Эти сегменты должны войти туда в особом «регламентированном» порядке: вход сегмента срабатывает на изменение конформации капсида, которое создает сайты связывания со следующим сегментом.

Некоторые вирусы растений состоят из нескольких частиц: их геномы состоят из сегментов, каждый из которых упакован в отдельный капсид.

Например, у вируса мозаики люцерны (ВМЛ) четыре разных одноцепочечных РНК независимо упаковываются каждая в отдельную оболочку из одних и тех же белковых субъединиц. Успех инфекции зависит от попадания в клетку хотя бы одной частицы каждого типа.

Бактериальный геном образует нуклеоид

Хотя у бактерий и нет структур с четкой морфологией эукариотических хромосом, их геномы, несомненно, структурно организованны и имеют вид плотных телец. На электронных микрофотографиях генетический материал бактерий можно увидеть как достаточно плотный комок (или скопление комков), занимающий около трети объема бактериальной клетки.

Если клетки Е. coli подвергнуть лизису, то фибриллы ДНК высвобождаются в виде петель, прикрепленных к поврежденной оболочке клетки.

• Е. coli было обнаружено несколько белков, отдаленно напоминающих хромосомные белки эукариот. Нуклеоид может быть изолирован в форме быстро седиментирующего комплекса, по массе на 80%

состоящего из ДНК (В аналогичных комплексах эукариот массовая доля ДНК равна 50%) Нуклеоид как структуру, можно распустить обработкой веществами, действующими на РНК или на белок. Возможная роль белков в стабилизации нуклеоида как структуры очевидна. Роль РНК пока не выяснена.

Геномная ДНК бактерий структурирована в виде многочисленных независимых хромосомных доменов с отрицательной сверхспирализацией.

Такая локальная автономность позволяет приписать бактериальной хромосоме структуру, схематично изображенную на рис.

Каждый домен состоит из петли ДНК основание которой каким-то (неизвестным) способом закреплено, что не позволяет вращательным событиям распространяться из одного домена в другой.

В ранних работах размер домена оценивали как ≈ 40 тпн ДНК но сравнительно недавний анализ показал, что размеры доменов, возможно, меньше и равняются ≈ 10 тпн. Это соответствует ≈ 400 доменам на геном Е. coli. Границы доменов, по всей видимости, распределены на хромосоме случайным образом, вне привязки к специализированным сайтам.

Существование обособленных доменов может способствовать подержанию разной степени сверхспирализации ДНК разных участков генома.

Организация генома эукариот

Хромосомы эукариот обретают морфологическую индивидуальность только на короткий промежуток времени, когда клетка делится. Только тогда каждую из них можно увидеть как компактную единицу. ДНК хромосом в 5-10 раз более конденсирована, чем ДНК интерфазного хроматина.

• все же в продолжение большей части жизненного цикла эукариотической клетки ее генетический материал визуально разбросан по ядру, и в нем нельзя различить отдельные хромосомы. От митоза до митоза структура интерфазного хроматина не претерпевает никаких видимых изменений, в частности, никаких возмущений в период репликации, когда количество хроматина удваивается.

Микрофотография среза через область ядра демонстрирует, что хроматин может быть поделен на два типа:

Большинство участков хроматина упакованы гораздо менее плотно, чем в митотической хромосоме. Такой материал называют эухроматином. Он выглядит рассеянным по ядру и занимает большую часть ядерной области

Некоторые участки хроматина упакованы очень плотно – до состояния, сравнимого с митотической хромосомой. Такой материал называют гетерохроматином. В его состав входят ДНК центромер и некоторые другие участки генома, которые за все время клеточного цикла претерпевают относительно малые колебания конденсированности. На фото гетерохроматин представлен серией обособленных комков.

Нередко разнообразные участки гетерохроматина слипаются в густо окрашиваемый хромоцентр (это описание относится к участкам, которые гетерохроматичны всегда, что называется, конститутивно; кроме конститутивного гетерохроматина есть еще факультативный, который представляет собой участки эухроматина, временно перешедшие в конденсированное состояние).

Пространственно, эухроматин и гетерохроматин непрерывно переходят один в другой, и соединения имеют вид того же волокна. Судя по всему, два типа хроматина отображают разные степени конденсированности ДНК.

Структурное состояние генетического материала коррелирует с его активностью. Гетерохроматин отличается от эухроматина следующими особенностями:

• Он перманентно конденсирован.

• Его ДНК зачастую состоит из многочисленных повторов небольшого числа нетранскрибируемых последовательностей.

• Плотность расположения генов на участках конститутивного гетерохроматина по сравнению с эухроматином, очень сильно снижена. Гены, попавшие в гетерохроматин или его окрестности, часто становятся неактивными

Строение хромосом

Морфологию хромосом обычно описывают на стадии метафазы или анафазы, когда они лучше всего видны в клетке. Для некоторых растений морфологию хромосом можно описать в профазе мейоза или митоза. В зависимости от расположения центромеры различают:

а) акроцентрические, или палочкообразные, хромосомы, у которых центромера находится на конце или второе плечо настолько мало, что его не различают на цитологических препаратах;

б) субметацентрические хромосомы с плечами разной длины;

в) метацентрические хромосомы, у которых центромера расположена посередине или почти посередине.

Центромера, или первичная перетяжка, – важнейшая часть хромосомы. Она определяет движение хромосомы и различима в виде более светлой зоны, которая движется в митозе, увлекая за собой несколько отстающие плечи хромосомы. Центромера имеет сложное строение: в ней находится ДНК с характерной последовательностью нуклеотидов, ассоциированная со специальными белками.

Хромосома обычно имеет одну центромеру. Ее потеря, например, в результате хромосомной аберрации, вызванной ионизирующим излучением, приводит к нарушению подвижности и потере хромосомы. Известны виды, содержащие полицентрические хромосомы с так называемой диффузной центромерой, например растения рода Lusula (ожика) или животные: Ascaris megalocephala, насекомые отряда Hemiptera и др. У этих видов даже фрагменты разорванных хромосом благополучно расходятся к полюсам.

Вторичные перетяжки в отличие от первичной перетяжки не служат местом прикрепления нитей веретена и не определяют угла изгиба хромосом при их движении. Вторичные перетяжки связаны с образованием ядрышек, их также называют ядрышковыми организаторами. Во вторичных перетяжках локализуются гены, ответственные за синтез рРНК. Синтез и созревание рРНК происходят в ядрышках.

Теломеры, или концевые участки хромосом, в значительной степени ответственны за существование хромосом как индивидуальных образований. Концы разорванных хромосом могут сливаться между собой, но никогда не сливаются с теломерами. Следовательно, именно теломеры препятствуют слипанию хромосом.

У некоторых хромосом есть спутники – участки, соединенные с остальной частью хромосомы тонкой нитью хроматина. Форма и величина спутника постоянны для хромосом, которые их имеют.

Кариотипом называют совокупность признаков, по которым можно идентифицировать данный хромосомный набор: число хромосом, их форма, определяемая прежде всего расположением центромер, наличие вторичных перетяжек, спутников, чередование эухроматиновых и гетерохроматиновых районов и т. д.

Таким образом, кариотип – это паспорт вида. Кариотип может быть изображен в виде идеограммы – схемы, на которой хромосомы располагают в ряд по мере убывания их длины.

На идеограмме принято изображать по одной из каждой пары гомологичных хромосом.

Наименьшее число хромосом среди эукариот имеет нематода Ascaris megalocephala univalens (2n = 2). Наибольшие числа хромосом встречаются у простейших и папоротников, для которых характерны высокие уровни полиплоидии. У них число хромосом достигает нескольких сот. Обычны диплоидные наборы, содержащие от десятка до нескольких десятков хромосом.

Нехромосомное наследование

До сих пор мы рассматривали сведения об организации и функционировании генов, расположенных в хромосомах ядра. Наследование этих генов подчинено менделеевским закономерностям. Наряду с этим существует внеядерная, или неменделевская, наследственность, обусловленная молекулами нуклеиновых кислот, реплицирующимися в цитоплазме в виде автономных структур или в составе клеточных органелл.

Генетика хлоропластов

Пластиды – самовоспроизводящиеся органеллы клетки. В отличие от хромосом ядра при распределении между дочерними клетками они не подчиняются строгим законам митоза и мейоза. Аппарат, управляющий распределением пластид, в настоящее время неизвестен и считается, что они попадают в дочерние клетки случайно при делении цитоплазмы, благодаря тому, что содержатся в клетке во множестве экземпляров (до нескольких сотен).

ДНК хлоропластов резко отличается от ДНК ядра. Она представлена циклическими молекулами длиной до 40-60 мкм, имеющими молекулярный вес 0,8-1,3х10⁸ дальтон. В одном хлоропласте может быть множество копий ДНК. Так, в индивидуальном хлоропласте кукурузы присутствует 20-40 копий молекул ДНК.

Длительность цикла и скорость репликации ядерной и хлоропластной ДНК, как было показано на клетках зеленых водорослей, не совпадают. ДНК хлоропластов не состоит в комплексе с гистонами.

Все эти характеристики ДНК хлоропластов близки к характеристикам ДНК прокариотических клеток. Более того, сходство ДНК хлоропластов и бактерий подкрепляется еще и тем, что основные регуляторные последовательности транскрипции (промоторы, терминаторы) у них одинаковы.

На ДНК хлоропластов синтезируются все виды РНК (информационная, транспортная, рибосомная). В пластидах обнаружен самостоятельный аппарат белкового синтеза, во многом отличающийся от цитоплазматического, характерного для эукариот, и сходный с аппаратом белкового синтеза прокариот.

Однако, основная масса белков хлоропластов контролируется ядерным геномом.

Генетика митохондрий

Митохондрии обеспечивают дыхание клеток растений, животных и эукариотических микроорганизмов. Подобно хлоропластам, это самовоспроизводящиеся полуавтономные органеллы клетки, содержащие кольцевые молекулы ДНК с различной длиной. ДНК в митохондриях не образует связь с гистонами. В этом отношении они напоминают бактериальные хромосомы.

• человека митохондриальная ДНК содержит 16,5 тыс. н.п., она полностью расшифрована. Найдено, что митохондриальная ДНК различных объектов очень однородна, отличие их заключается лишь в величине интронов и нетранскрибируемых участков. Все митохондриальные ДНК представлены множественными копиями, собранными в группы, кластеры.

Так в одной митохондрии печени крысы может содержаться от 1 до 50 циклических молекул ДНК. Общее же количество митохондриальной ДНК на клетку составляет около одного процента.

Синтез митохондриальных ДНК не связан с синтезом ДНК в ядре. Так же как и у бактерий митохондриальная ДНК собрана в отдельную зону – нуклеоид, его размер составляет около 0,4 мкм в диаметре. В длинных митохондриях может быть от 1 до 10 нуклеоидов. При делении длинной митохондрии от нее отделяется участок, содержащий нуклеоид (сходство с бинарным делением бактерий). Митохондрии имеют собственный аппарат белкового синтеза, отличающийся от цитоплазматического и близкий к аппарату белкового синтеза прокариот. Триплетный код митохондриальной синтетической системы отличен от такового, используемого в гиалоплазме. Несмотря на наличие, казалось бы, всех компонентов, необходимых для синтеза белков, небольшие молекулы митохондриальной ДНК не могут кодировать все митохондриальные белки, только лишь их небольшую часть.

Существует гипотеза о симбиогенетическом происхождении эукариотической клетки, в частности, о бактериальном происхождении хлоропластов, митохондрий и некоторых других клеточных органелл, содержащих ДНК, например кинетосом у простейших.

Мобильные генетические элементы

Мобильный (подвижный) элемент: элемент генома, способный перемещаться из сайта в сайт, либо в процессе прямого вырезания вставки ДНК, либо путем транскрипции элемента, обратной транскрипции образовавшейся РНК с образованием ДНК-копии и ее внедрением в другое место генома.

Мобильные генетические элементы (МГЭ), или "прыгающие гены" были открыты в 1947 г. американской исследовательницей Барбарой Мак-Клинток при изучении наследственности у кукурузы.

Встраиваясь внутрь какого-то обычного гена, МГЭ нарушает его работу, т.е. вызывает мутацию нормального гена. Когда МГЭ уходит на другое место, нормальная работа обычного гена возобновляется, мутация исчезает. Существует гипотеза, что МГЭ возникли из ДНК вирусов, так как многие вирусы могут встраиваться в ДНК клетки хозяина, а потом покидать ее.

Начиная с 50-х годов стали накапливаться данные о существовании большого числа МГЭ, присутствие которых в геноме не является обязательным, а их топография и количество могут варьировать в различных клетках, тканях и у разных индивидуумов. У прокариот такие элементы получили название транспозонов.

Отличительной особенностью мобильных элементов является способность существовать как в интегрированном с хромосомой виде, так и в виде отдельных макромолекул - эписом, плазмид, вирусных частиц. Почти 50 различных семейств мобильных элементов описаны у дрозофилы. Вместе эти последовательности составляют около 12% гаплоидного набора.

• геноме млекопитающих содержится до 50 000 диспергированных копий ретропозона Line размером около 6500 п.о. Семейство Аlu повторов,

содержащее от 300 до 500 тысяч копий, также относится к числу мобильных элементов генома.

Существуют хорошо документированные факты так называемой вирусной наследственности. У дрозофилы найдено несколько типов РНК-содержащих вирусов, которые живут в организме насекомого или в культивируемых клетках как симбионты, не вредя хозяину. Их генетические эффекты неизвестны.

Геномная РНК ретровирусов, попадая в клетку, строит свою ДНК-копию с помощью фермента обратной транскриптазы или РНК-зависимой ДНК-полимеразы, которую кодирует один из трех их генов. ДНК-копии вирусного генома включаются в хромосомы инфицированных клеток в форме провируса, следствием чего может быть злокачественное перерождение клеток. На ДНК-копии ретровирусов строится РНК-копия, которая в дальнейшем включается в вирион или служит промежуточной стадией при перемещении вируса в новую точку локализации. Сейчас известно, что ретровирусы, мигрируя, могут захватывать некоторые гены хозяина и переносить их не только в новое место в геноме, но и от организма к организму.

Открытие трансдукции у бактерий, а также захвата хромосомных генов онкогенными вирусами, успехи генной инженерии породили гипотезу о том, что наряду с так называемым вертикальным потоком генов, т. е. от родителей к детям, существует и так называемый горизонтальный перенос генов между особями одного и того же и разных поколений и даже между разными видами.

Очень часто наследование через пластиды и митохондрии, а также другие примеры нехромосомного наследования объединяют понятием цитоплазматическая наследственность. Все ранее рассмотренные случаи стабильного нехромосомного наследования связаны с клеточными органеллами, содержащими ДНК в качестве носителя наследственной информации. То же самое справедливо и в случае наследования симбионтов и вирусов. Следовательно, речь не идет о цитоплазме как носителе наследственных свойств, и в лучшем случае понятие «цитоплазматическая наследственность» должно означать место, локализацию в клетке конкретных дискретных носителей генетического материала. Кроме того,нехромосомные гены могут находиться и в ядре. Именно с учетом всех этих моментов термин «нехромосомное наследование» предпочтительнее в широком смысле слова.

Остается ли место для собственно цитоплазматического наследования в узком смысле, т. е. для детерминации признаков не органеллами клетки, а самой цитоплазмой? Да, такие случаи известны, однако при этом наследование признака оказывается нестабильным и его проявление затухает в течение одного или нескольких поколений. Наиболее яркий пример – наследование направления завитка раковины у прудовика. Существуют прудовики с правозакрученной и левозакрученной раковинами. Реципрокные скрещивания дают в F1 различный результат: гибриды наследуют признак матери. При первом скрещивании они все «правые», а во втором – все «левые». Благодаря тому, что прудовики – гермафродитные животные, у них возможно самооплодотворение. В F2 от обоих скрещиваний все потомки имеют правозакрученную раковину. И только в F3, также полученном путем самооплодотворения, в каждом из исходных реципрокных скрещиваний расщепление «правых» и «левых» раковин было 3:1. Проявление признака – направление закручивания раковины у прудовика – как бы отстает на поколение от генотипической формулы. Решающую роль в таком отставании играет генотип материнского организма, определяющий прежде всего свойства цитоплазмы яйцеклетки, от которой и зависит направление закручивания раковины. Этот признак формируется в раннем эмбриогенезе направлением веретена второго дробления. Такое явление получило название предетерминации цитоплазмы генотипом матери или материнского эффекта.

Критерии нехромосомного наследования

Можно ли на основе простых критериев, применяемых при генетическом анализе, различить хромосомное наследование и различные типы нехромосомного наследования? Обычно это сделать нелегко, и для окончательного вывода требуется комплекс оценок. Суммируя материал, изложенный в этой главе, отметим, что прежде всего нехромосомное наследование выражается в различии результатов реципрокных скрещиваний там, где их можно провести, используя явление гетерогамии. Однако различный результат реципрокных скрещиваний может быть получен и при сцеплении с полом.

Поэтому дополнительным критерием могут служить насыщающие скрещивания с заменой всех хромосом женского организма на хромосомы мужского организма.

Наконец, дополнительным критерием может служить повышенная чувствительность ДНК клеточных органелл или плазмид к некоторым агентам. Так, при обработке бромистым этидием у дрожжей теряется мтДНК.

Трудно разделить наследование через органеллы и плазмиды, с одной стороны, и через эндосимбионтов и вирусы – с другой. Наряду с генетическими критериями здесь необходим комплекс биохимических и цитологических подходов.

Таким образом, клетка может содержать сложную систему полуавтономных взаимодействующих генетических единиц, находящихся не только в хромосомах ядра, но и в нуклеоплазме, в клеточных органеллах (пластидах, митохондриях и др.), а также в цитоплазме. Наследование этих генетических детерминант порой трудно отличить от наследования эндосимбионтов и вирусов. Особенно это касается вирусов, поскольку провирусы могут объединяться с геномом клетки в ее ядре и приобретать свойства, характерные для эписом в интегрированном состоянии, т.е. наследоваться как часть генетического материала ядра.