Рнк как генетический материал.
Подавляющее большинство организмов содержат ДНК в качестве генетического материала. Лишь некоторые вирусы, например вирус табачной мозаики (ВТМ), лишены ДНК и состоят из белка и рибонуклеиновой кислоты – РНК. РНК отличается от ДНК по химическому составу тем, что в ней содержится сахар – рибоза, а пиримидиновое основание тимин заменено на урацил.
Генетическая роль РНК у ВТМ была доказана в экспериментах Г. ФренкельКонрата, А. Гирера и других в конце 50-х годов XX в. Каждая частица ВТМ содержит одиночную нить РНК длиной около 6400 нуклеотидов, заключенную в белковую оболочку. Оболочка ВТМ состоит примерно из 2130 идентичных субъединиц, каждую из которых составляют 158 аминокислотных остатков. Известны штаммы ВТМ, различающиеся по способности инфицировать различные формы растения-хозяина, по симптомам, которые сопровождают вирусную инфекцию, а также по аминокислотному составу субъединиц белка оболочки. Если отделить белок от РНК ВТМ, то РНК практически теряет инфекционность (на 99,9 %).
При реконструкции вирусных частиц (смешивании РНК и белка ВТМ) они вновь становятся инфекционными. Эти особенности ВТМ и были использованы в опытах. Реконструированные вирусные частицы были получены из РНК стандартного штамма и белка так называемого штамма НК. Штаммы различались аминокислотным составом белка оболочки. В отличие от штамма НК стандартный штамм не содержал гистидина и метионина.
Вирусные частицы-потомки, образовавшиеся в результате инфекции растений, по аминокислотному составу белка оболочки и другим признакам всегда соответствовали тому штамму ВТМ, от которого брали РНК. Таким образом была показана роль РНК как носителя генетической информации у ВТМ.
Итак, свойство наследственности оказалось связанным с нуклеиновыми кислотами, и прежде всего с ДНК.
Лекция № 2
ГЕНЫ И ИХ ЭКСПРЕССИЯ
Ген – это функциональная единица наследственности. Каждый ген – это последовательность нуклеотидов, несущая информацию о конкретном продукте (РНК или белке). Ключевые свойства гена были установлены еще Менделем более века назад. Эти свойства, сформулированные им в двух законах, представляют ген как дискретный фактор, передаваемый в неизменном виде от родителей к потомству. Ген может быть представлен несколькими альтернативными вариантами, которые называют аллелями.
диплоидных организмах, имеющих в клетке по два набора хромосом, от каждого из родителей потомству передается по одной копии каждой хромосомы, следовательно, и записанных в ней генов. Одна из двух находящихся в клетке копий гена является аллелем, унаследованным от отца, другая – унаследованным от матери. Сходство в поведении генов и хромосом позволило исследователям предположить, что гены расположены на хромосомах.
Хромосома содержит линейно расположенные на ней гены, причем каждый ген занимает на хромосоме строго определенное положение. Местоположение гена формально принято называть генетическим локусом, а аллели гена – это слегка отличающиеся варианты пос-ледовательности, находящиеся в данном генетическом локусе.
Первые попытки ассоциировать гены ферментами показали, что катализируемая ферментом стадия некоторого метаболического пути может быть блокирована мутацией в гене этого фермента.
Так сформировалась гипотеза один ген – один фермент. Каждый шаг метаболизма катализируется определенным ферментом, за продукцию которого ответственен один ген, и мутация в этом гене влияет на активность закодированного фермента.
Эта гипотеза требует некоторого уточнения для ферментов, состоящих более чем из одной субъединицы. Если все субъединицы одинаковы, то такой фермент – гомомультимер – действительно кодируется одним геном. Если же субъединицы различаются, фермент называется гетеромультимером. Для гетеромультимеров гипотеза «один ген – один фермент» является недостаточно общей, точнее будет сказать один ген – одна полипетидная цепь.
Мутация – это случайное событие, связанное с изменением структуры гена. Следовательно, вероятность того, что мутация нарушит или даже аннулирует функцию гена, достаточно высока. Большинство мутаций, влияющих на функцию генов, рецессивны. Они связаны с нарушением кодируемой геном функции (мутантный ген не может обеспечить наработку нормального белка). Когда клетка содержит один аллель дикого типа и один мутантный аллель (гетерозиготное состояние), аллель дикого типа способен обеспечить продукцию нормального фермента. В этом случае говорят, что аллель дикого типа является доминантным (т. е. единственный аллель дикого типа обес-печивает наработку достаточного количества активного белка). Если же количество белка, производимое единственным функциональным аллелем, недостаточно для сохранения дикого фенотипа, говорят о формировании промежуточного фенотипа (и частично доминантном аллеле в гетерозиготе).
Тест на аллелизм
Две мутации, приводящие к формированию одного и того же фенотипа, могут быть аллелями одного гена, но могут находиться и в двух разных генах, продукты которых выполняют одинаковую функцию. Для того чтобы понять, находятся мутации в одном гене или в разных, используют комплементационный тест. Тест заключается в том, что получают гетерозиготное по обеим мутациям поколение организмов (для этого скрещивают родителей, гомозиготных по каждой мутации).
Если мутации находятся в одном гене, генотипы гомозиготных родителей будут выглядеть следующим образом:
т2
–– и —
т1т2
Первый родитель передает по наследству один мутантный аллель (т1), ат второй родитель – другой (т2), таким образом, гетерозиготу можно записать как т1
––
т2
Поскольку ген дикого типа у потомка отсутствует, он будет иметь мутантный фенотип.
Если же мутации находятся в разных генах, то генотипы родителей можно записать так:
-
т1 +
+ т2
—–– и ——
т1 +
+ т2
Каждая хромосома в таком случае будет иметь одну копию гена дикого типа (обозначенную знаком плюс) и вторую – мутантную – копию. Генотип потомка от скрещивания приведенных выше родителей можно записать как:
т1 +
––––
т2
данном случае гетерозиготный потомок унаследует по одной функциональной копии каждого гена (+) и будет иметь дикий фенотип. Принято говорить, что такие гены комплементарны.
Влияние мутаций на фенотип
Мутации в генах могут оказывать различное влияние на фенотип.
Одним из способов определения функции гена является создание мутантного организма, дефицитного по данному гену. Мутация, полностью
выключающая ген (чаще всего в результате удаления гена или его существенной части), называется нуль-мутацией. Если ген жизненно важен для организма, нуль-мутация будет летальной.
Для установления эффекта, оказываемого геном на фенотип, важно охарактеризовать нуль-мутанта. Если мутация не влияет на фенотип, это может быть просто слабая мутация (когда синтезируемый мутантный продукт достаточно активен для того, чтобы выполнять свою функцию, даже если его активность несколько ниже или несколько иная, чем у дикого типа). С другой стороны, если нуль-мутант не влияет на фенотип, можно суверенностью утверждать, что кодируемая геном функция либо не важна, либо продублирована другим геном.
Нуль-мутации или мутации, влияющие на выполняемую геном функцию (но не обязательно полностью элиминирующие ее), называют мутациями с потерей функции (loss-of-function). Такие мутации рецессивны. А иногда мутации приводят к тому, что белок в результате изменения приобретает новую функцию; такие мутации называют мутациями с приобретением функции (gain-of-function). Такие мутации доминантны.
Не все мутации в гене приводят к детектируемым изменениям фенотипа. Мутации, не приводящие к очевидному эффекту, называют молчащими. Их, в свою очередь, делят на два типа: первые представляют собой нуклеотидные замены в последовательности ДНК, не приводящие к изменениям в аминокислотном составе соответствующего белка. Второй тип приводит к изменению аминокислотного состава, однако не приводит к изменению активности белка (такие мутации еще называют нейтральными заменами).
Множественный аллелизм
Различные варианты одного и того же гена называют множественными аллелями. Существование множественных аллелей делает возможным появление гетерозиготных организмов, несущих два разных аллеля одного гена. При этом взаимодействие между аллелями может принимать различные формы.
В простейшем случае ген дикого типа кодирует нормально функционирующий белок, а мутантный аллель (аллели) кодирует нефункциональный белок.
Однако довольно часты случаи, когда множественные аллели приводят к формированию нескольких фенотипов. Например, дикий тип локуса white у Drosophila melanogaster необходим для развития нормального красного цвета глаз. Свое название локус получил благодаря эффекту, оказываемому нуль-мутацией – у гомозиготных по мутации мух глаза белые.
Аллель w+ в гетерозиготном состоянии является доминантным по отношению к любому другому аллелю. Для приведенного примера с окраской глаз у мух выявлено множество различных мутантных аллелей. Каждый из этих (мутантных) аллелей содержит изменение в гене, которое лишь частично подавляет его функцию, а остаточное влияние выражается в проявлении характерного фенотипа (большинство аллелей w оказывают влияние на количество пигмента в глазу). В данном случае аллели названы в соответствии с цветом глаз, формирующимся у гомозиготы (по данному аллелю). Приведенные на рисунке варианты перечислены в порядке уменьшения количества пигмента (однако некоторые варианты, как, например, wsp, влияют не на количество, а на локализацию пигмента).
Когда в популяции присутствует множество аллелей данного гена, конкретный организм может быть гетерозиготой по двум разным аллелям. Фенотип такого организма зависит от природы остаточной активности каждого аллеля. Взаимовлияние двух мутантных аллелей не отличается от взаимодействия мутантного аллеля и аллеля дикого типа: один из аллелей может быть доминантным, проявлять неполное доминирование или кодоминирование.
У конкретного генетического локуса может быть более одного аллеля дикого типа. Ярким примером такой ситуации служит наследование групп крови у человека. Антиген 0 (или Н) продуцируется у всех людей и представляет собой определенную
углеводную группу, присоединяемую к белкам.
Локус АВО кодирует фермент галактозилтрансферазу, присоединяющий сахар к антигену 0. Специфичность этого фермента и определяет группу крови. Аллель В продуцирует фермент, который использует кофактор УДФ-галактозы для создания антигена В. Аллель А кодирует фермент, использующий кофактор УДФ-N-ацетилгалактозу для производства антигена А. А- и В-аллели трансферазы отличаются четырьмя аминокислотами, которые, вероятно, и оказывают влияние на способность распознавать тип кофактора. Аллель 0 содержит небольшую делецию, которая элиминирует активность фермента и модификации антигена 0 не происходит.
Приведенная схема объясняет, почему аллели А и В доминантны у гетерозигот АО и ВО: соответствующая активность трансферазы создает А или В антиген. Аллели А и В проявляют у гетерозигот АВ так называемое кодоминирование, поскольку проявляют активность обе трансферазы. Гомозиготы 00 являются нулевыми, у них нет активного фермента, таким образом, они дефицитны по обоим антигенам.
Ни А-, ни В-аллель не могут считаться уникальными аллелями дикого типа, поскольку они проявляют активность, отличную от потери или приобретения функции. Случаи, когда в популяции присутствует множество функциональных аллелей, обозначают термином полиморфизм.
Прокариотические гены
Сравнивая нуклеотидную последовательность гена с последовательностью аминокислот в белке, можно определить, колинеарны ли ген и белок (то есть су-ществует ли линейное соответствие между последовательностью нуклеотидов в гене и последовательностью аминокислот в белке). Например, такое линейное соответствие доказано для бактерий и их вирусов. Каждый бактериальный или вирусный ген состоит из протяженного участка ДНК, длина которого напрямую связана с числом кодируемых им аминокислот. В соответствии с устройством генетического кода ген, состоящий из 3N пн, должен кодировать белок, состо-ящий из N аминокислот.
Эукариотические гены
эукариот в пределах кодирующего региона могут находиться дополнительные последовательности, прерывающие участок, кодирующий тот или иной белок. В ходе экспрессии гена эти последовательности удаляются из РНК. В результате получается мРНК, последовательность которой колинеарна последовательности белкового продукта в точном соответствии с правилами генетического кода.
Регионы ДНК, составляющие прерванный ген, делятся на две категории:
Экзоны – это участки ДНК, из которых состоит зрелая мРНК. По определению, ген начинается и заканчивается экзонами, соответствующими 5'- и 3'-концам РНК.
Интроны – это внутренние регионы гена, удаляемые из первичного транскрипта и отсутствующие в зрелой РНК.
Порядок расположения экзонов одинаков для гена и кодируемой им РНК, но прерывистый ген длиннее, чем зрелая мРНК, поскольку такой ген содержит интроны.
Ген представляет собой участок генома, ограниченный точками, соответствующими 5'- и 3'-концам зрелой мРНК. Мы знаем, что транскрипция начинается на 5'-конце мРНК, а заканчивается за пределами 3'-конца зрелой мРНК (поскольку 3'-конец образуется в результате разрезания пре-мРНК). По обоим концам ген содержит регуляторные регионы, необходимые для инициации и (иногда) терминации его экспрессии.
Экспрессия генов
Если сопоставить последовательности гена и белка, окажется, что белок-кодирующая последовательность, расположенная между точками, соответствующими концам полипептидной цепи, является только частью гена. Поскольку ген не напрямую транслируется в белок, а посредством матричной (информационной) РНК (мРНК), существуют участки гена, не кодирующие полипептидную цепь, но входящие в структуру мРНК.
Процесс синтеза мРНК происходит по механизму комплементарного спаривания оснований. В отличие от репликации ДНК синтез мРНК идет лишь по одной из цепи ДНК. Последовательность мРНК комплементарна одной из цепей ДНК и идентична второй из цепей (за исключением замены Т на U). Видно, что последовательность верхней цепи ДНК (направленная от 5'-конца к 3'-концу) соответствует последовательности РНК.
Процесс, в результате которого ген дает начало белку, называют экспрессией гена. У бактерий экспрессия генов осуществляется в две стадии. Во время первой стадии, называемой транскрипцией, с одной из цепей ДНК синтезируется копия мРНК. Во время второй стадии мРНК транслируется в белок. Таким образом, трансляция – это процесс, в ходе которого последовательность мРНК, состоящая из триплетов, кодирующих аминокислоты, формирует соответствующий белок. Часть мРНК, называемая кодирующим регионом, состоит из последовательности нуклеотидов, кодирующих последовательность аминокислот в белке. Кроме кодирующего региона мРНК, как правило, содержит дополнительные регионы по концам молекулы; эти последовательности не принимают непосредственного участия в кодировании белка. 5'-нетранслируемый регион в англоязычной литературе называют лидером, а 3'-нетранслируемыйрегион – трейлером.
Ген включает в себя полную последовательность мРНК. Иногда в некодирующих регионах обнаруживают мутации, нарушающие функцию гена, из чего можно сделать вывод, что эти регионы составляют важную часть гена.
Поскольку цитоплазма у бактерий не отделена от геномной ДНК (у бактерий отсутствует ядерная оболочка), транскрипция и трансляция происходят у них в одном и том же компартменте клетки.
В отличие от бактерий, у эукариот транскрипция осуществляется в ядре. Для того чтобы транслировать мРНК в белок, необходимо транспортировать РНК в цитоплазму. Многие гены эукариот (и большинство генов высших эукариот)содержат внутренние регионы, не кодирующие белок – интроны. В безынтронных генах эукариот РНК-транскрипт по сути является мРНК(как у бактерий).В интронсодержащих генах синтезируемая на ДНК молекула представляет собой более длинный предшественник мРНК (пре-мРНК), и чтобы получить зрелую мРНК, из нее нужно удалить интроны (сплайсировать).
Модификации РНК, происходящие после ее синтеза на ДНК, называют процессингом РНК. Самой важной стадией процессинга РНК является сплайсинг. Во время сплайсинга эти участки удаляются из пре- мРНК, формируя молекулу мРНК, содержащую протяженную открытую рамку считывания. Помимо сплайсинга в ходе процессинга происходят и другие важные события: модификация 5'- и 3'-концов пре-мРНК.
Трансляцию осуществляет сложный ферментативный аппарат, включающий как белки, так и РНК. Ключевым участником процесса сборки белка является рибосома – большой макромолекулярный комплекс, состоящий из специальных РНК (рибосомальные РНК, обозначают как рРНК) и множества сравнительно небольших белков. В процесс распознавания аминокислот, соответствующих триплетам нуклеотидов, вовлечены так называемые транспортные РНК (тРНК); каждой аминокислоте соответствует как минимум один вид тРНК. Помимо этого, в процесс вовлечено множество вспомогательных белков.
Особо отметим, что РНК принимают участие в экспрессии генов не только как информационная матрица, но и в виде компонентов аппарата трансляции. рРНК и тРНК, так же, как и мРНК, кодируются генами и синтезируются в процессе транскрипции, однако последовательность их нуклеотидов не транслируется в белок.
Длина генов
У Saccharomyces cerevisiae подавляющее число генов (>96%) не содержат интронов, а интронсодержащиегены довольно компактны. У S. Cerevisiae практически нет генов, содержащих более четырех экзонов.
У насекомых и млекопитающих обратная ситуация. У них лишь немногие гены имеют непрерывную структуру (у млекопитающих – около 6%). В генах насекомых, как правило, мало экзонов, редко более 10.
Гены млекопитающих разбиты на большее число фрагментов (некоторые гены содержат десятки экзонов). Приблизительно половина генов млекопитающих несет более 10 интронов.
Оценивая последствия подобной организации для размера генов, мы увидим, что различия между дрожжами и высшими эукариотами весьма значительны. Средняя длина гена у дрожжей 1,4 тпн, и только немногие из них длиннее 5 тпн. Превалирование прерывистых генов у эукариот означает, что их гены намного длиннее кодирующих белок частей. Только некоторые гены мух и млекопитающих короче 2 тпн. Длина многих из них варьирует в диапазоне от 5 до 100 тпн. В среднем длина человеческого гена составляет 27 тпн.
Переключение с преимущественно безынтронных генов на преимущественно прерывистые происходит на уровне низших эукариот. У грибов (за исключением дрожжей) большинство генов уже имеет прерывистую структуру, однако содержит сравнительно малое число экзонов (<6) и имеет небольшую длину (<5 тпн.) Переход к длинным генам происходит у высших эукариот. Их размер становится заметно больше уже у насекомых. С увеличением длины гена корреляция между размером генома и сложностью организации организма исчезает.
увеличением размера генома интроны демонстрируют тенденцию к увеличению, при том что экзоны остаются довольно короткими. Экзоны в ряду рассматриваемых организмов становятся короче. У высших эукариот экзон среднего размера кодирует около 50 аминокислот, и общее распределение хорошо отражает идею о том, что гены эволюционировали путем добавления участков,
кодирующих небольшие отдельные домены белков. У разных групп высших эукариот размеры экзонов остаются практически неизменными. Тем не менее у позвоночных они более компактны (лишь немногие экзоны длиннее 200 пн), а кодирующие последовательности у дрожжей представляют собой один длинный непрерывающийся экзон. Для экзонов, кодирующих нетранслируемые 5'- и 3'-регионы, отмечена тенденция увеличения размеров относительно экзонов, кодирующих собственно аминокислотную последовательность.
Интроны могут сильно отличаться по размеру. У червей и мух средний интрон практически равен экзону. Однако у червей почти нет длинных интронов, а у мух они уже составляют заметную часть. У позвоночных размеры интронов представлены в более широком диапазоне: от сравнимых по размеру с экзонами (<200 пн) до длин, измеряемых десятками тпн и достигающих в отдельных случаях 50-60 тпн.
Как правило, очень длинные гены своим размером обязаны именно интронам, и их длина никак не связана с величиной кодируемого продукта. Также у высших эукариот отсутствует корреляция между размером гена, длиной мРНК и количеством экзонов. Размер гена, таким образом, в первую очередь зависит от длины его интронов. У млекопитающих, насекомых и птиц ген среднего размера примерно в 5 раз длиннее своей мРНК.
Некоторые последовательности ДНК кодируют более одного белка Большинство генов состоит из последовательности ДНК, кодирующей единственный белок (несмотря на то, что ген может содержать интроны и некодирующие концевые участки). Тем не менее, в некоторых случаях один и тот же участок ДНК может кодировать более одного белка.
Перекрывающиеся гены возникают, когда некий ген одновременно является частью другого, меньшего гена. Начало или конец такого гена кроме кодирования пол-норазмерного белка может одновременно кодировать укороченную форму белка. Результат такого перекрывания кодирующих регионов обычно выглядит так же, как если бы произошло расщепление части молекул полноразмерного белка с образованием двух форм – полноразмерной и неполной.
Более сложный случай перекрывания – когда одна и та же последовательность ДНК принимает участиев синтезе двух негомологичных белков.
В этой ситуации одна последовательность ДНК считывается более чем в одной рамке. В генах клеточных организмов ДНК обычно считывается лишь в одной из трех возможных рамок считывания. Между тем, в некоторых вирусных и митохондриальных генах два прилегающих друг к другу гена могут перекрываться, транслируясь в различных рамках считывания. Обычно размер перекрывания сравнительно невелик, так что большая часть последовательности, кодирующей каждый из белков, представлена отдельным регионом ДНК.
В некоторых генах Система альтернативного сплайсинга переключает процесс соединения экзонов. Таким образом, один ген может производить разные молекулы мРНК, отличающиеся набором экзонов. Присутствие некоторых экзонов в таких мРНК может быть необязательным (то есть они могут как присутствовать, так и отсутствовать в зрелой мРНК). Кроме того, некоторые экзоны могут быть взаимоисключающими (в зрелой мРНК может присутствовать лишь один из двух экзонов). Альтернативные формы мРНК производят белки, в которых одна часть общая, а другая вариабельная.
Альтернативный (или дифференциальный) сплайсинг ведет к синтезу с одного и того же гена белков с частично разными последовательностями аминокислот. Интересно, что большие геномы эукариот с протяженными (рассредоточенными) генами вдобавок обладают способностью к синтезу различных продуктов с одного локуса. У мух и червей альтернативный сплайсинг увеличивает количество белков относительно числа генов примерно на 15%, в то время как у человека альтернативно экспрессируется около 60% генов. Около 80% случаев альтернативного сплайсинга приводит к изменению белковой последовательности (остальные изменяют нетранслируемые области).