Лекция №4

РЕПАРАЦИЯ ДНК

Любой случай внесения в ДНК отклонений от обыкновенной двуспиральной структуры представляет угрозу для генетической конституции клетки. Вред, наносимый ДНК, минимизируют системы, распознающие повреждения и корректирующие их.

Системы репарации (Англ. repair – починка, восстановление, ремонт) столь же сложны, сколь и сам по себе репликативный аппарат, что показывает их важность для выживания клетки. Когда репаративная система исправляет изменение ДНК, оно не имеет последствий. Если системе это не удается, результатом может быть мутация. Измеряемая скорость возникновения мутаций отражает баланс между накоплением повреждений ДНК и скоростью их исправления (или попыток исправления). Многие системы репарации умеют воспринимать как сигнал к действию целый спектр искажений структуры ДНК, а клетки склонны иметь по нескольку систем, способных справляться с повреждениями ДНК. Для эукариот важность репарации огромна; в геноме человека идентифицировано >130 генов, причастных к репарационным процессам.

Как показано на рис. 1, системы репарации можно подразделить на несколько общих типов:

• Некоторые ферменты напрямую исправляют конкретные разновидности повреждений ДНК.

• Существуют пути репарации с вырезанием азотистых оснований или целых нуклеотидов. Все они работают по принципу удаления и замены материала.

• Существуют системы, использующие рекомбинацию для привлечения нетронутой копии последовательности, которая используется для замещения поврежденного участка дуплекса.

• Путь негомологичного соединения концов склеивает двухцепочечные «рваные» концы.

• Синтезом отрезков ДНК для замещения может заниматься несколько разных ДНК-полимераз. Типы повреждений, ведущих к запуску систем репарации, можно, в общем, подразделить на два класса:

• При однонуклеотидных заменах нарушенной оказывается нуклеотидная последовательность, но не структура ДНК в целом. Однонуклеотидные замены не влияют на процессы транскрипции или репликации (при которых цепи дуплекса разделены), но имеют эффект у будущих поколений клеток. Нарушение можно рассматривать как преобразование одного из азотистых оснований в другое, теперь уже плохо спаренное со своим партнером в комплементарной цепи. Однонуклеотидная замена может возникнуть в результате нарушения основания in situ или же быть следствием ошибки репликации. Некомплементарность сохраняется только до следующей репликации. Таким образом время, отведенное на ремонт повреждения до того, как оно будет зафиксировано репликацией, ограничено.

• Искажения структуры ДНК могут создавать физические помехи при репликации или транскрипции. Внесение ковалентных сшивок между основаниями одной цепи ДНК или между основаниями противоположных цепей ингибирует репликацию и транскрипцию. Общность всех этих изменений состоит в том, что вредоносная химическая модификация будет оставаться в ДНК и вызывать структурные дефекты и/или провоцировать мутации до тех пор, пока не будет удалена. Виды репарации Прямая репарация, при которой повреждение просто удаляется или исправляется на месте, встречается редко. Хорошим примером служит фотореактивация пиримидиновых димеров, при которой проблемные ковалентные связи восстанавливаются светозависимым ферментом. Фотореактивация широко распространена в живых системах (хотя отсутствует у плацентарных млекопитающих) и, по-видимому, особенно важна для растений. У Escherichia coli ее работа зависит от единственного гена phr, кодирующего фермент фотолиазу.

Несовершенность пар оснований представляет одну из главных целей для систем репарации. Для репарации некомплементарностей ДНК тщательно обыскивается на предмет азотистых оснований, которые, полагаясь в разных цепях ДНК друг напротив друга, не образуют правильную пару.

Некомплементарности, возникающие в процессе репликации, корректируются с различением новой и старой цепей и внесением исправлений преимущественно в новосинтезированный материал. Другие системы работают с последствиями химической модификации оснований, таких как дезаминирование. Важность этих систем подчеркивает тот факт, что мутации в генах, родственных дрожжевым генам, причастным к репарации некомплементарностей, вызывают рак у людей.

Неспаренные основания обычно корректируются эксцизионной репарацией. Ее инициирует фермент опознания, который обнаруживает или

Репарация с эксцизией оснований (BER) Репарация с эксцизией нуклеотидов (NER) само поврежденное основание, или изменение в пространственной конфигурации ДНК. Системы эксцизионной репарации бывают двух типов: • При репарации с эксцизией оснований (BER – base excision repair) система напрямую вырезает из ДНК поврежденное азотистое основание и заменяет его. Хорошим примером служит урацилгликозилаза, удаляющая урацилы, некомплементарные гуанинам. • При репарации с эксцизией нуклеотидов (NER – nucleotide excision repair) система вырезает из ДНК последовательность, содержащую поврежденное основание (или несколько поврежденных оснований); затем на замену вырезанному материалу синтезируется новый отрезок ДНК. Основные рабочие моменты эксцизионной репарации резюмирует рис. 2. Подобные системы есть у всех организмов.

Некоторые из них распознают в ДНК любые повреждения; другие настроены на отдельные типы поврежденных оснований. Нередко на один клеточный тип приходится множество различных систем эксцизионной репарации. Системы рекомбинационной репарации задействуют активности ферментов, участвующих и в генетической рекомбинации. Иногда их называют системами пострепликативной репарации, т. к. они приступают к работе после репликации. Такие системы эффективно борются с дефектами дочерней цепи, порожденными репликацией поврежденной матрицы. Рекомбинация используется, чтобы привлечь к восстановлению поврежденной последовательности ее интактную копию из другого (гомологичного) дуплекса и заполнить брешь с помощью этой копии.

Возможно, главная задача рекомбинационной репарации состоит в перезапуске застрявших репликативных вилок. Отличительной особенностью рекомбинационной репарации является необходимость иметь дело с двухцепочечными разрывами (ДЦР). ДЦР инициируют переходы цепей между дуплексами ДНК при гомологичной рекомбинации. Также они могут возникать при проблемах с репликацией и в этом случае срабатывать на запуск систем рекомбинационной репарации. Если ДЦР образуются как повреждение вследствие влияний окружающей среды (например, при облучении) или являются результатом укорочения теломер, они могут вызвать мутации. Неспециализированная система репарации двухцепочечных разрывов. Одна из систем обращения с ДЦР склеивает негомологичные концы ДНК. Двухцепочечные разрывы случаются в клеточной ДНК при разных обстоятельствах. Они могут встречаться при нормальной жизнедеятельности клетки (например при гомологичной рекомбинации).

Также они могут представлять собой повреждение ДНК – например, последствия облучения. Главный механизм репарации таких разрывов называется негомологичным соединением концов (NHEJ – nonhomologous end joining) и заключается в лигазной реакции, которая склеивает вместе тупые концы ДНК. Основные этапы негомологичного соединения концов (NHEJ) включают: узнавание разрывов ДНК, подравнивание и/или заполнение одноцепочечных концевых выступов и лигирование. Консервативность путей репарации среди млекопитающих, дрожжей, бактерий – один из важнейших выводов, сделанных при их изучении.

Однажды возникнув, механизмы репарации находятся под строгим контролем стабилизирующего отбора, отметающего мутантные варианты генов репарации. В результате многие белки репарации у человека имеют гомологи среди белков репарации E. coli. При мутациях в генах репарации наблюдаются серьезные последствия для здоровья человека, имеющие характер наследственных синдромов. Пример: заболевание пигментная ксеродерма — наследственное заболевание кожи, проявляющееся повышенной чувствительностью к ультрафиолетовому облучению. На открытых участках кожи возникает стойкая воспалительная реакция. Затем появляются участки атрофии кожи, сосудистые звездочки, неравномерная пигментация. К подростковому или юношескому возрасту в очагах поражения появляются доброкачественные и злокачественные опухоли. Характер наследственного дефекта заключается в отсутствии или малой активности ферментов, устраняющих повреждающий эффект ультрафиолетового излучения на клетки кожи.

МЕХАНИЗМЫ РЕКОМБИНАЦИИ

Рекомбинация генов осуществляется различными способами. Этот процесс может быть связан с перераспределением целых хромосом. Такой механизм в соответствии с третьим законом Г. Менделя обеспечивает независимое наследование признаков благодаря независимому наследованию несцепленных генов. Чаще всего рекомбинацию в узком смысле слова связывают с кроссинговером, т. е. с перекомбинацией генов, локализованных в гомологичных хромосомах. Об этом типе рекомбинации мы и поговорим сейчас.

Цитологическая демонстрация кроссинговера В профазе I мейоза на стадии диплотены у многих организмов хорошо различимы характерные фигуры, образуемые гомологичными хромосомами, – хиазмы. Еще в 1909 г. Ф. Янссенс предположил, что образование хиазм связано с обменами гомологичными участками гомологичных хромосом. Позднее Т. X. Морган связывал хиазмы с кроссинговером, происходящим согласно гипотезе К. Бриджеса (1915) по механизму разрыв-воссоединение.

Параллелизм событий, регистрируемых генетически и цитологически при рекомбинации сцепленных генов, был продемонстрирован в 1931 г. для двух объектов: кукурузы и дрозофилы. В обоих случаях был использован следующий принцип: сопоставление последствий кроссинговера (появление рекомбинантных классов) с физическими обменами гомологичных участков гомологичных хромосом. Эксперименты Xарриет Крейтон и Барбары МакКлинток с кукурузой, а К. Штерна с дрозофилой доказали, что в основе кроссинговера лежит реальный обмен участками гомологичных хромосом, однако механизм этого обмена оставался неясным.

Окончательное выяснение механизма реципрокных обменов и доказательство физического обмена участками родительских молекул ДНК при рекомбинации было получено значительно позже – в 1961 г. в эксперименте М. Мезельсона и Дж. Уэйгла, изучавших рекомбинацию у бактериофага λ. В этом эксперименте использовали биологические (генетические) и физические (изотопы 14С и 15N) маркеры, по которым контролировали физические обмены участками генетического материала при рекомбинации. Доказательство справедливости гипотезы разрыв-воссоединение было получено также Дж. Тэйлором в 1967 г. для кузнечика. Нимфам кузнечика вводили тимидин, меченный тритием так, чтобы он включался в хромосомы в последнем митотическом цикле перед мейозом.

Благодаря этому в результате последующей премейотической репликации каждая хромосома бивалента состояла из меченой и немеченой хроматид. Результаты реципрокных обменов между мечеными и немечеными хроматидами были четко видны на радиоавтографах. Митотический кроссинговер Кроссинговер возможен не только в мейозе, но и в митозе. В 1936 г. К. Штерн исследовал мух D. melanogaster генотипа у +//+ sn. Мутация у — желтое тело, sn (singed) — опаленные щетинки. Оба гена находятся в Ххромосоме, а центромера расположена справа от гена sn. Исследуемые

дигетерозиготы имели дикий фенотип по обоим признакам, однако изредка на теле некоторых мух появлялись двойные пятна: половина пятна — желтая с нормальными щетинками, другая половина — нормального серого цвета, но покрытая опаленными щетинками.

Появление таких двойных пятен К. Штерн объяснил митотическим кроссинговером на стадии четырех хроматид на участке sn-центромера. Действительно, если такой обмен произойдет, то при расхождении хромосом в митозе в половине случаев должны образовываться двойные пятна. Частота митотического кроссинговера значительно ниже (на 2-3 порядка) мейотического. Тем не менее митотический, или соматический, кроссинговер также можно использовать для генетического картирования. Молекулярный механизм кроссинговера Современные представления о молекулярном механизме кроссинговера в основном сложились в 60-е годы XX в. При этом более детально разработана гипотеза «разрыв-воссоединение» с учетом особенностей структуры ДНК. Наибольшую известность приобрела модель Р. Холлидея.

Эта схема рассматривает рекомбинацию на стадии четырех нитей между двумя из четырех хроматид бивалента. На рисунке показана рекомбинация только между двумя хроматидами. Еще две хроматиды остаются интактными, однако при рассмотрении конечного результата– расщепления в тетрадах – их также необходимо учесть. АВС и аbс – три тесно сцепленных маркера, судьба которых прослеживается на протяжении всего процесса рекомбинации. Стрелки символизируют антипараллельные цепи ДНК. Для рассматриваемой схемы очень существен учет полярности цепей. Весь процесс инициируют два однонитевых разрыва в нитях одинаковой полярности (рис. А).

На первом этапе молекулы ДНК, вступающие в рекомбинацию, образуют гибридные участки – так называемые гетеродуплексы, в которых одна цепь происходит от одной молекулы, а другая – от другой. Это полухиазма (рис. Б). На следующем этапе в точке перекреста нити разрываются. При этом рвутся либо нити, в которых были первичные разрывы, либо две другие нити. Предполагается, что оба типа разрывов равновероятны (рис. В и В’). Таким образом получаются либо две нерекомбинантные по фланговым маркерам молекулы (А-С и а-с), несущие гибридный участок – зону гетеродуплекса в районе среднего маркера В/b (рис. В), либо две молекулы, рекомбинантные по фланговым маркерам, и опять же гетеродуплексные в районе среднего маркера (рис. В’).

Конверсия гена.

Поскольку согласно модели Дж. Уотсона и Ф. Крика мутации – это изменения чередования нуклеотидов в ДНК, то аллели одного гена, в частности В/b, различаются по составу нуклеотидов (как минимум по одной паре оснований). Тогда в участке гетеродуплекса должна образоваться зона локального неспаривания оснований. Эти участки «узнают» специальные ферменты репарации, обеспечивающие структурную стабильность ДНК. Они устраняют то или другое неспаренное основание и заменяют его на комплементарное.

В таком процессе коррекции с равной вероятностью матрицей служит та или другая нить гетеродуплекса. Однако в каждом конкретном случае коррекция распространяется вдоль хроматиды (двуцепочечной молекулы ДНК) и в качестве матрицы используется одна и та же одиночная нить гетеродуплекса ДНК. Если в зону гетеродуплекса попадает несколько маркеров, то это должно привести к коконверсии (рис. Г и Г’). Существенный момент в рассмотренной схеме – необходимость дополнительного синтеза ДНК в процессе рекомбинации, в частности при репарации (коррекции) гетеродуплексов. Действительно, И. Хотта и X. Штерн обнаружили у растений (лилии) и у животных (мыши) в пахитене мейоза небольшой синтез ДНК репаративного типа, который дополняет основную репликацию ДНК в премейотической S-фазе.

У тех же объектов на стадии зиготены – пахитены показано повышение активности фермента, производящего однонитевые разрывы в ДНК, а также усиленный синтез белка, дестабилизирующего двойную спираль ДНК. Все это события, необходимые для рекомбинации.