ИММУННАЯ СИСТЕМА ОРГАНИЗМА

При положительном результате наблюдается свечение.

Интенсивность свечения зависит от количества образовавшихся иммунных комплексов, а, следовательно, от количества АТ в сыворотке больного.

При отрицательном результате свечение отсутствует.

Недостаток метода-субъективность, т.к. он основан на микроскопии и визуальном наблюдении.

Реакции прямой иммунофлуоресценции:

Применяется для иммуноиндикации, быстрого обнаружения АГ.

Компоненты реакции:

1.Исследуемый материал от больного (хАГ)

2.Диагностическая сыворотка, меченная флюорохромом

(АТ)

Из исследуемого материала готовят мазок на предметном стекле как для обычной микроскопии.

Препарат фиксируют.

На поверхность фиксированного мазка наносят меченные ФИТЦ сыворотки или моноклональные АТ.

Меченные флюорохромом АТ образуют с АГ исследуемого материала иммунные комплексы, и после отмывки остаются в системе.

Результат учитывают по интенсивности свечения комплексов АГ+АТ при люминесцентной микроскопии.

Радиоиммунный анализ (РИА)

Данный метод основан на маркировании антиглобулиновой сыворотки радиоактивным изотопом, сущность метода такая же, как и в РИФ, но комплексы АГ+АТ+АТ (меченное изотопом) выявляется с помощью счетчика радиоактивности (счетчик Гейгера).

Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул АГ и АТ.

Плюсы метода-наиболее чувствительный метод по определению АТ.

Минусы-работа с радиоактивным материалом.

Иммуноферментные методы (ИФА)

В данном методе применяют в качестве метки фермент, способный расщеплять определенный субстрат.

Плюсы метода-высокая чувствительность, высокая специфичность, простота учета результата.

В основе этого метода лежит расщепление субстрата под действием фермента, которое выявляется изменением окраски индикатора в случае положительного результата. Количество расщепленного субстрата будет пропорционально количеству связавшейся меченной антиглобулиновой сыворотки, т.е. количеству искомого объекта.

Данный метод используют как для серодиагностики, так и для иммуноиндикации. Известные АГ или АТ фиксируют на твердой фазе (96лучночные полистирольные планшеты). Конечный результат оценивают визуально или с помощью ИФА-ридеров по оптической плотности окрашенных продуктов.

Серодиагностическая ИФА

Компоненты реакции:

1.Эталонный АГ

2.Исследуемая сыворотка (хАТ)

3.Антиглобулиновая сыворотка, меченная ферментом

4.Субстрат к ферменту, которым мечена антиглобулиновая сыворотка

5.Индикатор

В лунки планшета адсорбируют известный АГ. Исследуемая сыворотка (хАТ) вносится в лунку планшета. При наличии в сыворотке соответствующих АГ АТ, образуется комплекс АГ+АТ, прочно связанного с планшетом.

Производят отмывку буферным раствором.

Затем в лунку вносят антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом.

Антитела антиглобулиновой сыворотки, меченной ферментов, взаимодействуют с искомыми АТ, образуется комплекс АГ+АТ+АТ меченные.

Производят отмывку буферным раствором.

Чтобы выявить этот комплекс, к нему добавляют субстрат для фермента и индикатор.

Если результат положительный, то цвет индикатора изменится.

ИФА для обнаружения АГ (иммуноиндикации) Также его называют «сэндвич» вариант ИФА.

Компоненты реакции

1.хАГ

2.АТ к искомому АГ

3.Меченные ферментом АТ к искомому АГ

4.Субстрат действия фермента

5.Индикатор

АТ адсорбируют в лунках планшета и вносят хАГ. После инкубации и отмывания в лунки вносят меченые ферментом АТ к искомому АГ.

Снова инкубируют и отмывают. Вносят субстрат и индикатор.

При изменении цвета индикатора говорят о положительной реакции.

Иммунохроматографический анализ (ИХА)

ИХА используют только для иммуноиндикации и проводят с помощью специальных тест-полосок.

Принцип действия состоит в том, что при погружении тест полоски в биологическую жидкость она начинает мигрировать вдоль полоски по принципу тонкослойной хроматографии.

Прямой иммунохроматографический анализ:

Компоненты реакции:

1.Исследуемый материал (хАГ)

2.Меченая диагностическая сыворотка, содержащая АТ против хАГ

3.Диагностическая сыворотка, содержащая АТ против хАГ

4.Антиглобулиновая сыворотка

На нижнюю часть тест-полоски нанесены в избытке меченные красящим веществом АТ, специфичные к искомому АГ.

На тестовой линии иммобилизованы АТ, специфические к данному АГ, а на контрольной линииантиглобулиновая сыворотка.

При нанесении исследуемого материала, содержащего хАГ, происходит их специфическое связывание с меченными АТ.

Затем иммунный комплекс достигает тестовую зону, где он связывается со специфическими АТ, образуя «сэндвич» АТ+АГ+АТметка.

Избыток не связавшихся меченых АТ достигает контрольной зоны, где специфически взаимодействует с антиглобулиновой сывороткой.

Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является положительным результатом теста.

При отсутствии искомых АГ в исследуемом материале, меченые АТ связываются только с антивидовыми АТ на контрольной линии, образуя лишь одну полоску.

Плюсы-быстрота и легкость в применении, возможность использования визуального способа учета результатов.

Препараты и их характеристика

Диагностикум-диагностический препарат, содержащий взвесь убитых микроорганизмов или их отдельные АГ.

Иммунные сыворотки-это сыворотки, полученные от иммунизированных лабораторных животных известным АГ. Общее название сывороток, сорежащих известные АТдиагностические сыворотки.

Эритроцитарный диагностикум-взвесь эритроцитов, с адсорбированными на них известными АТ.

Агглютинирующая сывороткасыворотки, полученные путем иммунизации лабораторных животных взвесью чистой культуры стандартных штаммов тех или иных бактерий или вирусов. В настоящее врем на практике используют адсорбированные агглютинирующие сыворотки-это сыворотки, лишенные групповых АТ.