3_MIKROBIOLOGIYa_metoda_IMMUNITET

положительный результат реакции.

Техника постановки РА по Видалю

Для проведения реакции исследуемую сыворотку разводят ИХН 1:50

для исключения неспецифической (ложноположительной) агглютинации.

Вкачестве антигена в этой реакции используют диагностикумы –

взвеси заведомо известных убитых и в отдельных случаях живых микроорганизмов (рис.18).

Учет РА проводят через 18-24 ч. по 4-х крестной системе в зависимости от выраженности хлопьевидного осадка и степени прозрачности

надосадочной жидкости:

«++++» - полная агглютинация (хлопья агглютината в осадке,

осадке, надосадочная жидкость мутная);

«-» - отсутствие агглютинации (хлопьев агглютината в осадке нет,

надосадочная жидкость мутная).

При оценке результатов РА по типу Видаля регистрируемый титр антител сравнивают с диагностическим — эмпирически установленным минимальным уровнем антител, позволяющим подтвердить диагноз данного заболевания. Величина диагностического титра различается в зависимости от вида инфекции, типа серологической реакции, возраста обследуемого. При интерпретации результатов развернутой РА Грубера зарегистрированный титр антител сравнивают со стандартным титром коммерческой агглютинирующей сыворотки, строго установленным при ее изготовлении на предприятии.

Область применения прямых РА.

РА просты в постановке и учете, не требуют дорогостоящего оборудования. Однако они не отличаются высокой чувствительностью,

поэтому область их использования достаточно ограничена:

серодиагностика узкого спектра инфекций (например, коклюша,

бруцеллеза, туляремии);

серотипирование бактерий в процессе бактериологического исследования;

оценка напряженности противококлюшного иммунитета.

Непрямые РА Непрямые РА относят к 2-х компонентным, но сложным реакциям,

поскольку в них один из компонентов адсорбирован на инертных частицах,

необходимых для визуализации результатов. Так, для РПГА в качестве частиц выступают формалинизированные эритроциты, для ЛА - частицы латекса,

КоА - белок А S.aureus. При взаимодействии растворимых антигенов с комплементарными антителами происходит склеивание частиц и образование видимого продукта. РПГА ориентирована в большей степени на определение антител, а ЛА и КоА — микробных антигенов непосредственно в материале от пациентов, что позволяет использовать данные виды реакций при экспресс-диагностике.

РПГА

по Бойдену - компонентами-участниками являются неизвестные

антитела и антигенный эритроцитарный диагностикум (рис.19);

по Рыцаю - компонентами являются неизвестный антиген и

антительный эритроцитарный диагностикум.

Рис. 19. Схема постановки РПГА по Бойдену

Реакцию ставят в 96-ти луночных полистироловых планшетах,

используя в качестве раствора электролита забуференные физ.растворы (ЗФР)

различного типа.

Учет РПГА проводят по системе «+» - «-» в зависимости от образования осадка эритроцитов в лунке полистиролового планшета в виде

«зонтика» или «пуговки» через 1,5-2 ч. с момента постановки, в то время как при ЛА и КоА продукт реакции носит характер хлопьевидного агглютината на стекле или специальных подложках, с временем формирования 1-2 мин.

РПГА по Бойдену применяется при диагностике многих инфекций, при оценке напряженности противодифтерийного, противостолбнячного и противокоревого иммунитета. Вариант по Рыцаю используется редко,

например, для регистрации белковых токсинов клостридий ботулизма,

стафилококкового энтеротоксина в крови обследуемых, капсульного антигена иерсиний чумы.

Реакции преципитации Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора

антигена при воздействии на него антитела в виде помутнения (преципитата).

Реакции преципитации ставят в пробирках (реакция кольцепреципитации) и полужидком агаре (иммунодиффузия по Оухтерлони,

Манчини, иммуноэлектрофорез).

Реакция кольцепреципитации

Компоненты:

1. Антиген (искомый) - содержится в исследуемом материале

(экстракты органов и тканей, бактериальных клеток, фильтра-ты патологического материала).

2. Антитело – стандартная преципитирующая сыворотка.

Применение:

Реакция кольцепреципитации применяется для диагностики инфекционных заболеваний (сибирская язва, чума, туляремия и др.);

выявления фальсификации пищевых продуктов (мясных, рыбных, мучных изделий, молока и др.); для определения видовой принадлежности белка

(кровяных пятен, спермы и др.) в судебной медицине.

Реакция иммунодиффузии

Основана на взаимодействии гомологичных антител и антигенов в агаровом геле с образованием видимых полос преципитации. Антиген и антитело в результате встречной иммунодиффузии в гель образуют макромолекулярные иммунные комплексы, регистрируемые визуально в виде белых (опалесцирующих) полос.

При наличии в растворе нескольких антигенов, диффундирующих независимо друг от друга, количество полос соответствует количеству антигена. Серологически родственные антигены образуют полосы преципитации, сливающиеся друг с другом, полосы же разнородных

антигенов перекрещиваются. Это позволяет определить общность антигенной структуры различных исследуемых объектов.

Постановка реакции:

Реакцию ставят в чашках Петри или на предметных стеклах, залитых прокипяченным и остуженным 0,8-1% раствором специального агара или агарозы слоем толщиной 1-2 мм. В центральную лунку вносят заведомо известную преципитирующую сыворотку, а в периферические – растворы

(экстракты) антигенов, молекулы которых будут диффундировать в агар навстречу антителам преципитирующей сыворотки. Наблюдение за результатами реакции ведут в течение 2-3 суток. Отмечают количество и место образовавшихся линий преципитации, устанавливая таким образом наличие специфически реагирующих систем антиген-антитело. Этим же методом можно определить идентичность исследуемых антигенов.

Пример учета реакции:

5 4

1.Между антигенами 1 и 2 образовались непересекающиеся линии преципитации, что свидетельствует о полной идентичности этих антигенов по отношению к преципитирующей сыворотке и друг к другу.

2.Между антигенами 2 и 3 образовались частично перекрещивающиеся линии преципитации, что свидетельствует о частичной идентичности этих антигенов по отношению друг к другу и их родстве с преципитирующей сывороткой.

3.Между антигенами 3 и 4 образовались полностью перекрещивающиеся линии преципитации, что свидетельствует о полной неидентичности этих антигенов по отношению друг к другу.

4.Между антигеном 5 и преципитирующей сывороткой линии преципитации отсутствуют, что свидетельствует об отсутствии их родства.

Применение:

Реакция иммунодиффузии широко используется в диагностике заболеваний, вызываемых вирусами, риккетсиями и бактериями,

продуцирующими экзотоксины. Большое практическое значение реакции иммунодиффузии имеет при определении токсигенности коринебактерий дифтерии.

Реакция иммуноэлектрофореза (РИЭФ) позволяет провести анализ и идентификацию отдельных антигенов в многокомпонентной системе. РИЭФ основана на электрофоретическом разделении антигенов в геле с последующей их преципитацией антителами иммунной сыворотки. В основе РИЭФ лежит явление миграции антигенов и антител в электрическом поле навстречу друг другу, в результате чего в месте их взаимодействия образуются дугообразные линии их преципитации, количество,

расположение и форма которых дают представление о составе исходной смеси антигенов.

Реакции нейтрализации

При соединении антигенов и антител в случае их комплементарности происходит блокада повреждающего действия микробов и их токсинов антителами. При введении указанной смеси антиген-антитело в организм животных или чувствительные биологические объекты (куриный эмбрион,

культура тканей) отсутствие повреждающего действия свидетельствует о его нейтрализации антителами.

Методы иммуноанализа Преимуществами методов иммуноанализа по сравнению с другими

группами серологических реакций являются: высокие специфичность и чувствительность; стандартность; автоматизация процесса; возможность регистрации низкомолекулярных белков.

Область применения:

иммунодиагностика инфекционных заболеваний бактериальной,

вирусной, паразитарной этиологии;

иммунодиагностика неинфекционной патологии (аллергические,

аутоиммунные заболевания, иммунодефициты, опухоли и др.);

оценка иммунного статуса,

оценка напряженности противоинфекционного иммунитета

иммуногенетические исследования.

Несмотря на очевидные преимущества этих методов и обширную область использования в практике, они требуют наличия дорогостоящего оборудования и диагностических тест-систем.

ИФА, РИА и МФА принципиально отличаются между собой системой меток, ковалентно соединяемых с одним из компонентов-участников, и

способами регистрации результатов. Так, в ИФА используется ферментная метка (пероксидаза хрена) и хромогенный субстрат (ТМБ - 3,5-

тетраметилбензидин), изменяющий цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазы, что определяет использование приборов,

работающих на принципе спектрофотометрии, для учета результатов по регистрации оптической плотности пробы; для РИА - радиоактивная метка

(I125) с регистрацией радиоактивности комплекса с помощью гамма-счетчика,

а для МФА — флюорохромы и металлы лантаноидной группы, способные флюоресцировать при облучении сине-фиолетовым спектром (ФИТЦ — флюоресцеина изотиоционат натрия), с регистрацией в люминесцентном микроскопе.

ИФА

Существуют множество вариантов постановки ИФА, которые подразделяются на:

гомогенные, когда оба компонента (антиген и антитело) находятся в жидкой фазе, отличающиеся простотой и быстротой постановки, но в то же время ориентированные только на качественный анализ и определение низкомолекулярных белков;

гетерогенные, или твердофазные (ELISA - Enzyme-Linked immunosorbent Assay), в которых один из компонентов фиксируется на твердой фазе,

наиболее часто используемые в лабораторной практике.

Вкачестве «твердой фазы» используют полистироловые или поливиниловые планшеты с плоским дном, шарики, пленки или пробирки,

обладающие высокой сорбционной способностью, в лунках которых адсорбируют антигены (или антитела). При последовательном добавлении к связавшимся с полистиролом антигенам или антителам других компонентов

выявления искомых антител в сыворотке крови обследуемых. Широко используется для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний (аллергических - определение общего IgE и специфического IgE

кразличным аллергенам, аутоиммунных заболеваний - определение антител

кинсулину, ДНК, аутоантигенами др., онкологических), оценки иммунного статуса.

Компоненты:

1)антиген – стандартный препарат, который в производственных условиях сорбирован на планшете;

2)искомые антитела – содержатся в сыворотке крови иди других образцах от обследуемых;

3)неспецифический конъюгат – антитела любого вида животных против Fc-фрагмента человеческих антител, меченые ферментной меткой;

4) субстратно-индикаторная смесь, состоящая соответственно из перекиси водорода в малой концентрации и ТМБ (3,5-тетраметилбензидин) -

хромогенного индикатора, изменяющего цвет при разложении перекиси водорода под влиянием пероксидазной метки.

субстратно-индикаторная смесь неспецифический конъюгат искомые антитела

известный антиген планшет

Рис. 20. Схема непрямого ИФА

Техника постановки

Последовательность внесения в лунки планшета компонентов при постановке различных вариантов ИФА однотипна и включает этап сорбции

«базового» компонента на твердой фазе, а затем этапы «контакта» последовательно вносимых компонентов, после каждого из которых выполняют промывку планшета для удаления не связавшихся компонентов реакции. Учет ИФА проводят по изменению цвета реакционной смеси в лунках только с использованием приборов (мультискана или ридера),

измеряющих оптическую плотность в каждой из лунок.

Одной из модификаций ИФА и хорошей альтернативой является

Dot–ИФА. Это метод точечного иммуноферментного анализа (dot-Elisa-

точечный твердофазный иммуноферментный анализ), позволяющий снизить стоимость диагностических процедур и не требующий дорогого оборудования. В dot-ИФА минимальные объемы растворов антигена или антител наносят на нитроцеллюлозную подложку (мембрану) в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Субстраты, дающие нерастворимые продукты ферментативной реакции, на белом нитроцеллюлозном фильтре в присутствии индикатора образуют легко различимые цветные пятна, в

результате чего отпадает нужда в дорогих фотометрах. Фильтры с результатами анализа можно хранить в темноте в течение многих лет.

Простота постановки позволяют использовать ее как экспресс-метод, в

полевых или домашних условиях. Метод dot-ИФА позволяет определять как антигены живых или разрушенных вирусов и бактерий, так и антитела.

РИФ (МФА)

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний

(чума, туляремия, бруцеллез, хламидиоз, туберкулез и др.), а также для оценки иммунного статуса (определение СD-антигенов клеток иммунной системы).

Варианты РИФ (МФА)

Прямой МФА (рис. 21) – предназначен для выявления искомых антигенов с помощью моноклональных антител, меченых флюорохромом ФИТЦ. При наличии в исследуемом материале искомых антигенов наблюдается свечение образовавшегося иммунного комплекса,

регистрируемое в люминесцентном микроскопе. Недостатком этого метода является необходимость приготовления широкого набора специфических антител против каждого изучаемого антигена, меченых ФИТЦ.

ФИТЦ-меченые моноклональ- ные антитела против искомого антигена

искомый антиген

Рис. 21. Схема прямого МФА

Непрмой МФА (рис. 22) – более сложная реакция, предназначенная для обнаружения искомых антигенов или, реже, антител. На первом этапе реакции искомый антиген связывается со специфическими кроличьими