Тема занятия: «Метаболизм и типы питания бактерий. Питательные среды. Принципы культивирования микроорганизмов и выделения чистых культур»

План занятия

1.Рассмотрение процессов метаболизма, типов питания и механизмов транспорта питательных веществ в бактериальную клетку.

2.Характеристика бактериологических питательных сред.

3.Изучение принципов культивирования бактерий.

4.Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов.

Методические указания к выполнению практического занятия.

1. Типы метаболизма, питания и механизмов транспорта питательных веществ в бактериальную клетку.

В состав клетки прокариотов входят два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК), белки, липиды, углеводы, минеральные вещества и вода (Табл.10)

Таблица 10 Химический состав бактериальной клетки

1

Метаболизм - совокупность ферментативных реакций и химических превращений, происходящих в микробной клетке и направленных на получение энергии и превращение простых химических соединений питательных веществ в более крупные молекулы, которые входят в состав компонентов бактерий.

2

Метаболизм

Для осуществления процессов метаболизма микроорганизмы поглощают питательные вещества из внешней среды.

По способу проникновения питательных веществ в бактериальную клетку микроорганизмы подразделяют на:

голозои – бактерии, способные утилизировать плотные частицы пищи с помощью функции «внешнего питания». Они имеют мощный ферментативный аппарат, работающий на поверхности клетки, гидролизирующий субстрат до простых водорастворимых молекул;

голофиты – бактерии, утилизирующие питательные вещества только в виде относительно простых молекул в водных растворах.

Проникновение различных веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости их молекул в липидах или воде, рН среды, их концентрации, проницаемости мембран и др.

Условно можно выделить следующие виды транспорта питательных веществ через ЦПМ (табл.11):

пассивный перенос (простая и облегченная диффузия);

активный транспорт;

транспорт с транслокацией химических групп.

Таблица 11

3

Пути поступления питательных веществ через ЦПМ в бактериальную клетку

Типы питания бактерий сложны и многообразны. При их классификации по типу питания учитывают источник углерода, энергии и донора водорода (рис. 1).

4

По источнику углерода

По источнику электронов (ионов водорода)

Рис. 1. Классификация микроорганизмов по типу питания

С учетом всех трех источников значимые для медицинской микробиологии виды по типу питания относят к гетерохемоорганотрофам (сокращенно – хемоорганотрофы).

По способу синтеза питательных веществ микроорганизмы подразделяют на:

прототрофы – микроорганизмы, способные синтезировать все необходимые им органические вещества из глюкозы как единственного источника углерода и солей аммония как единственного источника азота;

5

ауксотрофы – микроорганизмы, которые получают отдельные органические вещества в готовом виде из окружающей среды или из организма хозяина, нуждаются в факторах роста при культивировании на искусственных питательных средах.

2.Характеристика бактериологических питательных сред

Влабораторных условиях микроорганизмы культивируют на специальных питательных субстратах, называемых искусственными

питательными средами.

Бактериологические питательные среды (БПС) – это препараты, предназначенные для выявления, культивирования, дифференциации, транспортирования и хранения микроорганизмов.

Требования, предъявляемые к питательным средам:

наличие набора питательных веществ, адекватных физиологическим потребностям определенной группы микроорганизмов (источники аминного азота, металлы, минеральные соединения, факторы роста);

наличие определенных физико-химических свойств;

стерильность;

стандартность и простота приготовления;

соответствие сроков и условий хранения.

Оценку качества питательных сред ведут по следующим показателям:

1.Биологические свойства:

характер роста культуры на среде;

типичность биологических свойств возбудителя в чистой культуре (морфологических, биохимических, серологических, фаголизабельность);

скорость роста;

чувствительность среды – максимальное разведение культуры, обеспечивающее визуально обнаруживаемый рост колоний искомого штамма в течение определенного времени и при определенной температуре на всех засеянных чашках;

6

дифференцирующие свойства (для дифференциальнодиагностических сред) – выраженность и четкость дифференциации разных групп микроорганизмов по характеру колоний и другим признакам роста, в том числе изменению цвета среды;

ингибирующие свойства (для элективно-селективных сред) – степень подавляющего воздействия на рост сопутствующих микроорганизмов;

эффективность (для жидких сред) – выход микробных клеток с 1 мл питательной среды (в млрд/мл) и прирост числа микроорганизмов относительно засеянного количества; определяется по концентрации микробных клеток в среде после инкубации.

2.Физико-химические свойства:

растворимость;

рН;

вязкость;

консистенция;

прочность студня агаровых сред;

содержание белка, общего и аминного азота, хлоридов;

внешний вид готовых сред (гомогенность, прорачность, цветность и др.).

Классификация питательных сред

1.По консистенции:

жидкие (мясопептонный бульон (МПБ), 1% пептонная вода и др.);

полужидкие (концентрация агара 0,3-0,7%) (полужидкий мясопептонный агар (МПА), полужидкие цветные ряды и др.);

плотные (концентрация агара 1,5-2%) (МПА; среда Эндо и др.).

2.По составу:

эмпирические (на основе естественных продуктов): кровяной агар, сывороточный агар, молочно-желточно-солевой агар (МЖСА);

7

полусинтетические (химический состав установлен частично): казеиново-угольный агар (КУА),

синтетические (химический состав определен точно): среда 199, Сотона, Игла.

3.По назначению (Табл.12)

Таблица 12 Классификация питательных сред по назначению

8

1.Среда Эндо (дифференциально-диагностическая среда для выделения и идентификации кишечных бактерий): питательный агар 1,5%, лактоза 1%, индикатор - фуксин, обеспеченный сульфитом натрия.

Свежеприготовленная среда бесцветна или имеет бледнорозовый цвет. Лактоза разлагается микроорганизмами до альдегида и кислоты. Альдегид в свою очередь освобождает фуксин из фуксинсульфитного комплекса, в результате чего колонии окрашиваются в красный цвет (лактозопозитивные, lac+). При росте эшерихий также происходит кристаллизация фуксина, в результате чего появляется зеленоватый металлический блеск (фуксиновый глянец) колоний.

2.«Цветные» ряды Гисса (набор нескольких пробирок со средами, приготовленными по рецептуре Гисса), чаще используются полужидкая консистенция: 0,4% питательного агара, 1% определенного углевода или многоатомного спирта (глюкоза, лактоза, мальтоза, манит, сахароза и др.) и индикатор BP (смесь водного голубого и розоловой кислоты).

При расщеплении углевода до кислых продуктов цвет индикатора и среды меняется, при расщеплении до кислоты и газа наблюдаются еще и разрывы в среде.

Определенный вид бактерий разлагает не все углеводы, представленные в ряду Гисса, поэтому цвет меняется только в некоторых пробирках и получается "пестрый ряд".

3.Среда Китт-Тароцци (для культивирования анаэробных микроорганизмов): МПБ, содержащий несколько кусочков печени или других тканей животных в качестве поглотителя свободного кислорода, 1% глюкозы, 0,05% агара (для снижения окислительновосстановительного потенциала среды); перед посевом бактерий среду регенерируют кипячением.

9

3. Изучение принципов культивирования бактерий.

Микроорганизмы, за исключением облигатных внутриклеточных паразитов, культивируют на искусственных питательных средах. Условия культивирования зависят от биологических свойств соответствующих микроорганизмов.

При культивировании необходимо:

выбрать адекватную питательную среду, отвечающую физиологическим потребностям микроорганизмов;

соблюдать оптимальный температурный режим:

большинство патогенных и условно-патогенных микроорганизмов являются мезофилами с температурными границами роста от 200С до 400С, при оптимальной температуре 370С; психрофилы — бактерии, размножающиеся при низких температурах, например, бактерии рода йерсиний (оптимум при10-120С); термофилы - растут при 40-600С, например, оптимальной температурой для кампилобактерий является

420С;

учитывать тип дыхания микроорганизмов (для анаэробов применяют особые методы культивирования);

соблюдать сроки культивирования, которые зависят от периода генерации микроорганизмов.

Период генерации – время между двумя делениями бактериальной клетки, которое зависит от вида микроорганизмов, возраста культуры, характера питательной среды. Для большинства видов микроорганизмов он составляет в среднем 20 мин., что определяет появление видимого роста на питательной среде через 1820 часов. У некоторых бактерий период генерации более длительный - 14-15 часов, поэтому видимый рост на среде наблюдается через 2-6 нед.

10

4. Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов.

Чистая культура – это популяция бактерий одного вида или разновидности, выращенная на искусственной питательной среде.

Выделение чистой культуры необходимо:

при клинико-диагностических и профилактических исследованиях;

при санитарной оценке объектов окружающей среды;

для производства антибиотиков, иммунобиологических

препаратов.

Идентификацию чистой культуры проводят в логарифмическую фазу роста микробной популяции до вида или варианта (био-, серо-, хемо-, резистенс-, фаговара) по ряду основных свойств:

морфологические – форма бактерий, размеры, взаимное расположение в микропрепаратах;

тинкториальные – способность воспринимать красители (при окраске по Граму);

культуральные – характер роста на плотных и жидких питательных средах, условия культивирования;

биохимические – набор ферментов, присущий определенному виду или варианту микроорганизмов, который определяют на дифференциально-диагностических средах, с помощью СИБов, микротестсистем или автоматизарованных баканализаторов;

антигенные – набор антигенов, характерный для данного вида

и варианта, определяемый путем постановки серологических реакций, преимущественно реакций агглютинации.

При идентификации некоторых культур дополнительно изучают:

чувствительность к бактериофагам;

чувствительность к антибиотикам, колицинам и др.

11

Чистую культуру в бактериологических лабораториях в большинстве случаев получают из изолированных колоний, выросших на пластинчатых питательных средах.

Схема выделения и идентификации чистых культур бактерий

Исследуемый материал

1 этап (нативный материал):

ориентировочная микроскопия

подготовка материала к исследованию

посев на пластинчатые питательные среды с целью получения изолированных колоний и на среды обогащения для выделения и накопления чистой культуры

2этап (изолированные колонии):

описание культуральных, морфологических и тинкториальных свойств культуры

пересев на скошенный питательный агар (бульон) или другие среды для накопления чистой культуры

3этап (чистая культура):

проверка чистоты накопленной культуры в мазке

идентификация по комплексу биологических свойств (посев на дифференциально-диагностические среды, постановка серологических реакций и др.)

Заключение

о выделенной культуре (указать вид, вариант)

Схемы с описанием выделения и идентификации чистых культур факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных микроорганизмов находятся в приложении №1 и 2. Выполняется первый этап исследования.

12

1. Типы энергетического метаболизма и классификация бактерий по потребности в молекулярном кислороде.

Энергетический метаболизм (катаболизм, диссимиляция) -

процесс распада химических соединений до более простых, при котором выделяемая энергия запасается в клетке в виде молекул АТФ.

Различают эндогенный энергетический метаболизм (при окислении собственных клеточных структур) и экзогенный, или традиционный (при окислении субстратов, поступающих в клетку из внешней среды).

Основными типами экзогенного энергетического метаболизма являются дыхание и брожение (рис.2)

Дыхание - способ получения энергии в результате окисления органических субстратов (преимущественно углеводов), при котором конечным акцептором электронов и ионов водорода является

кислород При аэробном дыхании конечным акцептором выступает

молекулярный кислород. Распад субстрата идет при наличии О2 в среде не < 20% до СО2 и Н2О с полным освобождением энергии, заключенной в исходном субстрате. Это наиболее эффективный тип энергетического метаболизма.

Типы энергетического метаболизма у гетероорганотрофов

Рис. 2. Типы энергетического метаболизма бактерий

13

При анаэробном дыхании конечным акцептором являются неорганические соединения, содержащие «связанный» кислород (нитраты, нитриты, сульфаты, карбонаты и др.). Распад идет в условиях отсутствия молекулярного кислорода.

Брожение - способ получения энергии в результате анаэробного расщепления органических соединений до более простых органических соединений, которые становятся конечными акцепторами электронов и ионов водорода. В продуктах брожения сохраняется значительная часть энергии, которая не может быть использована клеткой.

По характеру превалирующего органического продукта, образующегося при брожении выделяют несколько видов брожения:

спиртовое (у дрожжей)

молочно-кислое (у молочно-кислых стрептококков, лактобацилл)

муравьинокислое (у энтеробактерий)

пропионовокислое (у пропионобактерий)

маслянокислое (у ряда клостридий) и т.д.

Кдыханию также относят окисление бактериями некоторых

неорганических соединений, не подверженных ассимиляции (Н2S – «сероводородное дыхание», Fe+3 – «железное дыхание»).

Классификация микроорганизмов по типу дыхания представлена в табл.13.

14

Таблица 13

Классификация микроорганизмов в зависимости от потребности в молекулярном кислороде

15

16

17

2. Изучение методов создания анаэробных условий

Существует несколько методов создания анаэробных условий

физические:

эвакуационно-заместительный (откачивание воздуха с помощью вакуумного насоса из герметически замкнутой емкости, например, анаэростата или анаэробного бокса, с последующей заменой на бескислородную газовую смесь);

посевы специальными методами - «уколом» в столбик агара, который затем заливают вазелиновым маслом; по методам Перетца, Бурри, Вейон-Виньялю и др. (схема 2);

химические: использование автономных анаэростатов - герметичных сосудов из прозрачного пластика с плотно закрывающейся крышкой в комплекте с газогенирирующими пакетами, которые содержат химические соединения, связывающие молекулярный кислород; используются для создания анаэробных или микроаэрофильных условий;

биологические:

посев по методу Фортнера – совместное выращивание микроорганизмов с разным типом дыхания: на один сектор агара засевают культуру аэробов, на другой – анаэробов, края чашки парафинируют. Аэробы при росте поглощают кислород и создают условия для развития анаэробов;

заражение восприимчивых лабораторных животных (например, культивирование лептоспир в организме морских свинок);

смешанные (использование одновременно нескольких методов).

1

Разведения по методу Вейнберга производят с помощью пастеровской пипетки с запаянным концом, которой последовательно переносят культуру анаэробов, выросших в среде Китт-Тароцци, в 3 пробирки со стерильными физ.растворами и три пробирки с расплавленными и остуженными до 45-500С полужидкими агарами с 1% глюкозой.

3. Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов

Выполняется 2-ой этап исследования чистых культур факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробной культуры в соответствии с Приложениями 1 и 2.

При описании двух типов колоний факультативно-анаэробных бактерий учитывают отсутствие или наличие пигмента, придающего культуре определенный цвет и оптическую плотность.

Пигменты бактерий могут иметь различный состав (табл.14) и растворимость.

По растворимости пигменты подразделяются на: - жирорастворимые (каротиноидные)

3

-водорастворимые (фенозиновые)

-спирторастворимые (пирроловые)

-нерастворимые (меланиновые)

Тема: Ферменты бактерий, их классификация. Методы выявления ферментативной активности микроорганизмов. Выделение чистых культур микроорганизмов (продолжение).

1. Классификации ферментов бактерий по биохимической активности, локализации, концентрации.

Все питательные вещества и элементы вступают в микробной клетке в реакции метаболизма при обязательном участии ферментов.

Ферменты – это специфичные, эффективные белковые катализаторы всех химических превращений, происходящих в клетке.

Ферменты бактерий классифицируют по ряду признаков

1)по биохимическому действию:

оксидоредуктазы;

гидролазы;

изомеразы;

трансферазы;

лиазы;

лигазы

2)по локализации относительно микробной клетки:

эндоферменты – локализуются внутри клетки (в ЦПМ, цитоплазме, периплазматическом пространстве);

экзоферменты – выделяются в окружающую среду: а) ферменты, осуществляющие «внешнее питание»;

б) ферменты патогенности (плазмокоагулаза, лецитиназа, коллагеназа и др.).

4

3)по концентрации:

1)конститутивные – постоянно синтезируются в определенных

концентрациях; 2) индуцибельные – находятся в клетке в следовых

концентрациях, но при наличии соответствующего субстрата в окружающей среде количество их резко возрастает.

Ферментный состав является стабильным признаком для каждого вида микроорганизмов, поэтому обнаружение ферментативной активности чистых культур микроорганизмов применяют при их идентификации.

Существуют группы ферментов, которые определяют при идентификации микроорганизмов в процессе бактериологического исследования:

сахаролитические (разлагают углеводы, многоатомные спирты);

протеолитические (разлагают белки, аминокислоты);

ферменты патогенности.

2. Методы определения ферментативной активности микроорганизмов

Существует несколько основных способов изучения ферментативной активности бактерий (рис.3)

5

Способы изучения ферментативной активности микроорганизмов

Автоматизированные методы с использованием приборов

Рис. 3. Основные способы определения ферментативной активности микроорганизмов

1.Посев чистой культуры на традиционные питательные среды дифференциально-диагностического ряда, содержащие питательную основу, субстрат и ииндикатор; принцип учета результатов основан на изменении цвета среды в ответ на изменение рН в результате разложения субстрата ферментами вырастающих бактерий.

2.Посев исследуемого материала, содержащего смесь бактерий, на коммерческие хромогенные агары, в которых содержатся дифференциально-диагностические и селективные компоненты. Вырастающие колонии различных родов или даже видов микроорганизмов приобретают характерные контрастные цвета. Характер окраски определяется взаимодействием родо- и видоспецифичных ферментов микроорганизмов с хромогенными субстратами. Например, на хромогенном агаре для обнаружения и подсчета уропатогенных бактерий, выделяемых из мочи,

Enterococcus faecalis формирует мелкие голубые колонии,

Pseudomonas aeruginosa - бесцветные, Staphylococcus aureus —

золотисто-желтые, Kelbsiella pneumoniae - сине-фиолетовые,

6

слизистые, Escherichia coli — розово-красные. Также разработаны хромогенные среды для выделения и дифференциации сальмонелл от энтеробактерий, различных видов стафилококков, дрожжеподобных грибов рода Candida и др. Неоспоримым преимуществом хромогенных агаров является сокращение сроков бактериологического исследования за счет совмещения этапов выделения и биохимической идентификации чистой культуры.

3.Внесение взвеси чистой культуры в пробирки с последующим помещением в них шаблонов-носителей - СИБов — систем индикаторных бумажных (диски или полоски хроматографической бумаги, покрытые защитной пленкой и содержащие определенный субстрат и индикатор).

4.Внесение взвеси чистой культуры в коммерческие микро-тест- системы (МТС) - полистироловые планшеты или панели, в лунках которых промышленным способом нанесены дегидратированные дифференциально-диагностическими среды. Мультитесты сгруппированы в планшетах «тематически» - для биохимической идентификации определенного семейства или рода бактерий. Примеры: ПБДЭ и ПБДС («Диагностические системы», Г.Н.Новгород), семейство систем API (BioMerieux, Франция), Enterotube П (Becton Dickinson, США) STRETO-тест и STAPHY-

ТЕСТ (Lachema, Чехия) и др. Они позволяют повысить точность результатов за счет стандартизации и увеличения количества тестов (от 15 до 30), снизить трудоемкость и время исследования.

5.Использование бактериологических анализаторов (рис.4) - полностью автоматизированных систем, исключающих участие сотрудников на этапах инкубации, учета и анализа результатов. Выпускаются баканализаторы BD Phоenix (Becton Dickinson,

США), VITEK и VITEK2 (bioMerieux, Франция), WalkAway

(Германия), Sensititre (Великобритания) и др. Принцип работы: взвесь чистой культуры микроорганизмов в определенной концентрации автоматически вносится в ячейки тест-системы, в которых находятся субстраты для биохимической идентификации. Панели тест-систем помещают в отсек прибора, предназначенный

7

для инкубации, на 4-6 ч. (экспресс-режим) или 24 ч. (обычный режим). Результат взаимодействия микроорганизмов с реактивами в каждой ячейке, имеющей штрих-код, фиксируется считывающим модулем прибора. Работа считывающего модуля может быть основана на спектрофотометрическом методе детекции (результаты учитываются в каждой лунке по изменению цвета в процессе жизнедеятельности бактерии), флюоресцентном учете, хроматографическом анализе жирных кислот микробной клетки и др. Прибор управляется компьютером, который вместе с монитором встроен в блок анализатора. После считывания результатов выполняется их компьютерный анализ с выдачей ответа, имеющего 99%-ю достоверность.

Рис. 4. Баканализатор BD Phоenix.

3. Выделение и идентификация чистых культур микроорганизмов

8

Выполняется 3 этап исследования чистых культур факультативно-анаэробных бактерий и 3-4 этапы исследования чистой культуры облигатно-анаэробных бактерий в соответствии с Приложениями 1 и 2.

Приложение 1

Выделение чистых культур аэробных бактерий и их идентификация

1-й этап: Производят посев смеси микробов шпателем – площадками, петлей – секторами и штрихами на пластинки с МПА; посевы помещают в термостат при 370С.

2-й этап: описывают выросшие колонии 2-х типов, готовят из ½ колонии каждого типа мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют; оставшиеся половинки колоний обоих типов отсевают на скошенные МПА для накопления чистых культур и термостатируют сутки.

3-й этап: а) проверяют чистоту накопленных культур в мазке б) определяют ферментативную активность: производят посев

чистой культуры Гр- палочек в среды короткого "пестрого" ряда с глюкозой, лактозой, маннитом, мальтозой, сахарозой для обнаружения сахаролитических ферментов, в МПБ - для определения индо- и сероводородообразования; Гр+ кокки исследуют в каталазном тесте и при положительном результате отсевают чистую культуру в цитратную кроличью плазму, на МЖСА, маннит в аэробных условиях и глюкозу анаэробно (для выявления соответственно плазмокоагулазы, лецитиназы и сахаролитических ферментов). Все посевы помещают в термостат на сутки; свертывание плазмы учитывают через 2, 4, 18 и 24 ч.

4-й этап: а) учитывают изменения "пестрого" ряда, выделение индола и сероводорода при посеве Гр- палочек; изменения цитратной кроличьей плазмы, окисление маннита, ферментацию глюкозы, характер роста на МЖСА (пигмент и наличие лецитиназной активности) при посеве стафилококка

9

б) проводят идентификацию выделенных культур, пользуясь справочными таблицами 10 и 11 и выдают ответ с указанием рода и/или вида микроорганизма.

Примечание: для постановки каталазного теста на предметное стекло наносят каплю 3% р-ра Н2О2 и петлю исследуемой культуры. При появлении пузырьков газа тест считают «+».

10

Таблица 33

Характеристика культуры №1 аэробной Гр- палочки по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим признакам в сравнении со сходными микроорганизмами.

11

Таблица 34 Характеристика культуры №2 аэробных Гр+ кокков по морфологическим, тинкториальным, культуральным,

биохимическим признакам в сравнении со сходными микроорганизмами

12

Приложение 2

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий и ее идентификация

1-й этап: Производят посев суспензии из почвы в регенерированные кипячением и охлажденные до 450С среды - молоко по Тукаеву, Вильсон-Блер и КиттТароцци. Посевы помещают в термостат при 370С на сутки, просматривая их через 3-6 часов.

2-й этап: а) учитывают рост на средах Китт-Тароцци, молоке по Тукаеву, Вильсон-Блер.

б) из культуры, выросшей на среде Китт-Тароцци, готовят мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют.

в) производят разведение культуры, выросшей на среде Китт-Тароцци, по методу Вейнберга, выполняют посев методом Перетца с целью выделения чистой культуры анаэробов. Посевы помещают в термостат на сутки.

3-й этап: изучают характер роста колоний; из части колонии готовят мазки по Граму, микроскопируют и производят отсев второй половины колонии в среду Китт-Тароцци для накопления чистой культуры, помещают в термостат на сутки.

4-й этап: а) проверяют чистоту культуры в мазке б) производят посев в полужидкие среды "пестрого" ряда

Гисса, разлитые высоким столбиком, и на пластинку яично-желточного агара (ЯЖА) для выявления лецитиназной активности, свидетельствующей о продукции α-токсина, термостатируют сутки.

5-й этап: а) учитывают изменения сред "пестрого" ряда, наличие лецитиназной активности б) проводят идентификацию выделенной культуры с

помощью справочной таблицы 12 и выдают ответ с указанием вида микроорганизма.

13

Таблица 35 Характеристика культуры №3 анаэробной Гр+ палочки по морфологическим, тинкториальным, культуральным, биохимическим признакам, токсинообразованию в сравнении со сходными

микроорганизмами.