protokoly_2020

Протокол № 27 Микробиологическая диагностика сифилиса

Вкачестве материала для исследования от больного с подозрением на сифилис на 4 неделе заболевания взяли отделяемое твердого шанкра и сыворотку крови.

Вотделяемом твердого шанкра проводили обнаружение возбудителя сифилиса Т.рallidum (окраска по Романовскому-Гимзе и темно-полевая микроскопия) и его генома (ПЦР).

Для обнаружения Т.рallidum готовили фиксированный мазок окрашивали по Романовскому-Гимзе и рассматривали его с помощью световой микроскопии. В мазках – бледно-розовые извитые спиралевидные

(8-12 завитков) микроорганизмы. Для темно-полевой микроскопии готовили препарат «раздавленная капля». В мазках – подвижные извитые микроорганизмы на темном фоне.

Для обнаружения генома (ДНК) Т.рallidum ставили ПЦР с использованием праймеров, предназначенных для выявления возбудителя сифилиса. Результат ПЦР положителен.

В сыворотке крови больного определяли антитела к специфическим антигенам Т.рallidum. Для этого ставили непрямой ИФА для обнаружения суммарных специфических антител (IgM +IgG) по схеме 1.

Схема 1.

Схема постановки ИФА

По завершении постановки ИФА реакцию останавливали с помощью стоп-реагента и производили учет (схема 2).

Схема 2.

Результат положителен: в сыворотке крови обнаружены суммарные специфические антитела (IgM +IgG) к Т.рallidum.

С целью установления периода заболевания раздельно ставили непрямой ИФА для обнаружения уровня специфического IgM и специфического IgG по схеме 3.

Схема 3.

Схема постановки ИФА

По завершении постановки ИФА реакцию останавливали с помощью стоп-реагента и производили учет (схема 4) с использованием мультискана.

Обнаружены специфические IgM и IgG к Т.рallidum.

Заключение

На основании полученных результатов подтвержден диагноз «сифилис» у обследованного больного.

Протокол № 28

Санитарно-микробиологическая оценка стерильности перевязочного материала

1 этап исследования

В предбокснике биксы с ватными тампонами, простерилизованными паровым методом, протирали снаружи стерильной салфеткой, смоченной 6 % раствором Н2О2 и оставляли на 30 мин, затем перенесли в бокс. С помощью стерильного пинцета полностью погрузили три тампона из партии в три пробирки с тиогликолевой средой и еще три тампона в три пробирки с жидкой средой Сабуро без антибиотиков. Посевы в тиогликолевой среде поместили в термостат при 320С, в среде Сабуро – при 220С; инкубировали 8 суток с ежедневным просмотром.

2 этап исследования

В течение всего срока наблюдения во всех средах не обнаружили видимых признаков роста микроорганизмов, среды остались прозрачными. Из всех пробирок сделали мазки, окрасили по Граму. При просмотре в иммерсионной системе микроскопа в мазках микроорганизмы также не обнаружили.

Заключение: на основании проведенного санитарно-микробиологического исследования выдали ответ «стерильно».

Протокол № 29

Санитарно-бактериологическое исследование предметов окружающей среды в ЛПУ

1 этап исследования

1. Произвели отбор пробы с лабораторного стола в боксе бактериологической лаборатории методом смывов. Для этого тщательно протирали его поверхность площадью 100 см2 увлажненной стерильной марлевой салфеткой размером 5x5см, после чего поместили ее в пробирку 2 мл 0,1% пептонной воды с добавлением 1% тиосульфата натрия (для нейтрализации хлорсодержащих дезинфицирующих растворов).

2.По 0,2 мл смывной жидкости засеяли в следующие питательные среды: для выявления стафилококков — в пробирку с 5 мл 6,5% солевого бульона, условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ) - в пробирку с 5 мл среды Кесслера, сальмонелл - в пробирку с 5 мл селенитовой среды; синегнойной палочки - в среду N 8 (5 мл бульона для выделения синегнойной палочки) и на пластинку среды №9 (агар для определения синегнойной палочки по наличию пигмента пиоцианина).

3.Все пробирки поместили в термостат при 370С на сутки.

2 этап исследования

1.Учет роста: в солевом бульоне, среде Кесслера и селенитовой среде рост бактерий отсутствовал; в среде №8 - рост в виде серовато-серебристой пленки, на пластинке среды №9 - колонии с ровными и слегка волнистыми краями, гладкой блестящей поверхностью, с характерным запахом «жасмина» и сине-зеленым пигментом.

2.Из колоний, выросших на среде №9, приготовили мазки по Граму; при микроскопии в них — Грампалочки.

3.Для накопления чистой культуры колонии со среды №9 пересеяли на скошенный МПА и посевы поместили в в термостат при 370С на сутки.

3 этап исследования

1. Учет роста: на скошенном МПА увидели рост бактерий в виде полупрозрачного налета сине-зеленого цвета, сам МПА приобрел такой же оттенок.

2.Для проверки чистоты накопленной культуры сделали мазок по Граму; при микроскопии обнаружили Грампалочки.

3.Для идентификации чистую культуру бактерий по ферментативным свойствам

-поставили оксидазный тест - «-»;

-посеяли в две пробирки с полужидкими средами с глюкозой по ХьюЛейфсону, разлитые обычным и высоким столбиками (тест окисленияфементации глюкозы — ОФ-тест);

-внесли в пробирку с СИБом для выявления фермента лезиндекарбоксилазы. Посевы поместили в в термостат при 370С на сутки.

4. Сделали посев чистой культуры на скошенный МПА и посев поместили в в термостат при 420С на сутки.

4 этап исследования

1. Учет роста - среда с глюкозой обычным столбиком изменила цвет, а высоком столбике

— нет — окисление «+»/ферментация «-»;

2. Идентифицировали выделенные бактерии по морфологическим, тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам как

P.aeruginosa.

Заключение: на основании обнаружения P.aeruginosa дезинфекция поверхности столов в бактериологической лаборатории является не эффективной.

Протокол № 30

Санитарно-бактериологическое исследование молока пастеризованного

1 этап исследования

1.Для определения КМАФАнМ из пробы молока пастеризованного приготовили разведения 1:10; 1:100; 1:1000. По 1 см 3 каждого разведения внесли в стерильные чашки Петри и залили 10 см 3 расплавленного и охлажденного до 45 о С агара. Посевы поместили при 30 0 С на 72 ч.

2.Для определения колиформных бактерий из по 1 см 3 цельного продукта и его разведений 1:10 и 1:100 внесли в пробирки с 5 см 3 среды Кесслера с лактозой.

3.Для определения S.aureus по 1 см 3 засевают в 2 пробирки с 9 мл солевого бульона.

4.Для определения сальмонелл 25 мл молока внесли во флакон с 250мл забуференной пептонной воды.

5.Посевы в среде Кесслера, солевом бульоне и пептонной воде поместили в термостат при

370 С на 24 ч.

2 этап исследования

1.Расчет КМАФАнМ. Подсчитали количество выросших внутри и на поверхности МПА колоний в каждой чашке, сделали перерасчет на 1 мл цельного молока и нашли среднеарифметическое из полученных результатов: - в чашке с посевом из разведения 1:10 — 100 колоний - в чашке с посевом из разведения 1:100 — 20 колоний - в чашке с посевом из разведения 1:1000 — 3 колонии

(100 колоний х 10 + 20 колоний х 100 + 3 колонии х 1000) : 3 = 2х103

2.В среде Кесслера рост бактерий в виде помутнения и газообразования был только в пробирке с посевом из разведения молока 1:10 (индекс БГКП 0,1).

3.В солевом бульоне и пептонной воде рост бактерий не обнаружили.

4.Сравнили полученные результаты с нормативами.

Заключение: на основании результатов санитарно-бактериологического исследования считаем, что молоко пастеризованное соответствует требованиям СанПин по микробиологическим показателям.

Протокол № 31

Санитарно-бактериологическое исследование воды питьевой централизованного водоснабжения (определение колиформных бактерий титрационным методом и общего микробного числа)

1 этап исследования

При отборе пробы водопроводной воды для определения микробиологических показателей металлический кран предварительно простерилизовали путем обжига горящим тампоном, смоченным 96%-ным раствором этилового спирта. Произвели спуск воды продолжительностью 10 мин при полностью открытом кране, после чего из крана набрали 500 мл воды в стерильный стеклянный флакон с притертой пробкой.

1.Для определения общего микробного числа (ОМЧ) из исследуемой пробы воды два объема по 1 мл внесли в 2 стерильные чашки Петри и в каждую из них добавили 6-8 мл расплавленного и остуженного агара; перемешали содержимое вращательными движениями, передвигая чашки по поверхности стола. После застывания агара чашки поместили в термостат вверх дном и инкубировали при 37о С 24 часа.

2.Для количественного определения общих и термотолерантных колиформных бактерий (ОКБ и ТКБ) титрационным методом произвели посев 3-х объемов воды по 100 мл во флаконы с 10 мл концентрированной лактозо-пептонной среды (ЛПС), 3-х объемов воды по 10 мл - в пробирки с 1 мл концентрированной ЛПС и 3-х объемов воды по 1 мл - в 10 мл ЛПС обычной концентрации. Посевы инкубировали при 37о 24–48 ч.

2 этап исследования

Учет результатов

1.Подсчитали количество колоний, выросших в обеих чашках, и разделили на два. Результат - 36 КОЕ/мл (количество колониеобразующих единиц в 1 мл пробы воды).

2.В двух флаконах ЛПС с посевами воды по 100 мл увидели рост бактерий в виде помутнения и газообразования. В третьем флаконе, так же как и во всех пробирках с ЛПС с посевами воды по 10 и 1 мл, рост отсутствовал.

Из флаконов с признаками роста бактерий сделали высев на два сектора среды Эндо (для подтверждения принадлежности выросших бактерий к колиформным). Чашки инкубировали при 37о С 18-20 ч.

3 этап исследования

1.Учет результатов: на обоих секторах среды Эндо отметили рост типичных лактозоположительных колоний (темно-красных, с металлическим блеском). После снятия колоний петлей на среде остался «отпечаток» красного цвета, что подтвердило присутствие ОКБ в двух объемах воды по 100 мл, изначально засеянных на ЛПС.

2.Произвели расчет наиболее вероятного числа (НВЧ) бактерий в 100 мл с помощью таблицы. Результат: НВЧ бактерий в 100 мл воды - 0,9.

3.Для определения термотолерантных колиформных бактерий сделали посев двух типичных lac+ колоний, выросших на каждом секторе среды Эндо, в полужидкие среды с лактозой. Посевы поместили в термостат при 440 С на 24 ч.

4 этап исследования

1. Учет результатов: разложение лактозы до кислоты и газа во всех пробирках, подтвердившее наличие ТКБ в двух объемах воды по 100 мл.

2. Сравнили полученные результаты исследования водопроводной воды с нормативами качества воды централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения, представленными в СанПин, по ОМЧ и содержанию ОКБ/ТКБ.

Заключение: исследуемая проба воды централизованного хозяйственнопитьевого водоснабжения не удовлетворяет требованиям качества по ОКБ и ТКБ в соответствии с СанПин.

Протокол № 32

Санитарно-микробиологическое исследование воздуха бокса бактериологической лаборатории

1 этап исследования

1.Отбор проб воздуха выполнили аспирационным методом с помощью пробоотборного устройства ПУ-1Б. Пропустили:

- 100л воздуха на пластинку МПА (для определения ОМЧ), - 250л воздуха на пластинку МЖСА (определение S.aureus),

- 250л воздуха на пластинку среды Сабуро (определение дрожжеподобных и плесневых грибов).

2.МПА и МЖСА инкубировали сутки при 370С, дополнительно МЖСА оставили еще на сутки при комнатной температуре; Сабуро – 4 дня при температуре 22-280С.

2 этап исследования

1.Для определения ОМЧ подсчитали количество выросших на пластинке МПА колоний, умножили на 10 для пересчета на 1 м3 воздуха. Результат -

150КОЕ/м3.

2.Подсчитали количество характерных для S.aureus колоний с зонами опалесценции, выросших на МЖСА, умножили на 4 для пересчета на 1 м3 воздуха. Результат - 8 КОЕ/м3. Для подтверждения принадлежности микроорганизмов к стафилококкам из подсчитанных колоний приготовили мазки, окрасили по Граму. Обнаружили Грам+ кокки, расположенные гроздьями. Сделали пересев колоний на скошенный МПА для накопления чистой культуры выделенных бактерий.

3.На среде Сабуро рост колоний плесневых и дрожжевых грибов отсутствовал.

3 этап исследования

1.Учет результатов посева на скошенном МПА: обнаружили рост бактерий в виде золотистого налета.

2.Проверка чистоты культуры: в мазке - Грам+ кокки, расположенные гроздьями.

3.Для определения ферментативных свойств выделенных из воздуха бактерий провели посев в ЦКП (для определения плазмокоагулазы) и в среды Гисса с маннитом и мальтозой.

4.Посевы поместили в термостат на сутки при 370С.