protokoly_2020

Протокол № 8 Постановка реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)

В качестве исследуемого материала использовали парные образцы сыворотки больного с подозрением на туляремию, взятые в конце 1-ой недели заболевания и спустя 10-14 дней, разведенные 1:5.

Сыворотки инактивировали при +56°С в течение 30 минут и адсорбировали 50%-ной взвесью формализированных эритроцитов барана.

1-й этап:

Произвели титрование образца 1-й парной сыворотки в лунках 1-го ряда согласно схеме с ЗФР (забуференным физиологическим раствором) путем приготовления последовательных двукратных разведений от 1/10 до 1/2560. Для этого в девять опытных и одну контрольную (КД – контроль диагностикума) лунки внесли по 0,05 мл ЗФР. В 1-ю лунку ряда добавили 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешали и 0,05 полученного раствора перенесли во 2-ю лунку; снова перемешали и так далее до 9-й лунки, из которой избыточный объем 0,05 мл удалили в емкость с дез.раствором.

Аналогично произвели титрование образца 2-й парной сыворотки в лунках 2-го ряда.

Во все опытные лунки и КД добавили по 0,05 мл капли антигена – туляремийного эритроцитарного диагностикума, представляющего собой взвесь убитых туляремийных бактерий.

Учет реакции:

2-й этап (учет результатов):

Титр сыворотки в РПГА определяли по последнему положительному результату (склеивание эритроцитов в лунке в виде «зонтика»). Титр 1-й парной сыворотки равен 1/20, титр 2-й парной сыворотки - 1/80.

Таким образом, в динамике заболевания произошло 4-х кратное и более нарастание титров специфических противотуляремийных антител, что свидетельствовало в пользу диагноза «туляремия» (диагностическим является 4-х кратное нарастание титра специфических антител в динамике заболевания).

Заключение:

На основании результатов РПГА зарегистрировано 4-х кратное нарастание титров специфических противотуляремийных антител в образцах парной сыворотки, позволяющее подтвердить диагноз «туляремия».

Протокол № 9 Постановка реакции преципитации (РП) в геле по Элеку

для определения токсигенности С.diphtheriae

В качестве исследуемого материала использовали три штамма C.diphtheriae, выделенные от больных с подозрением на дифтерию.

На поверхность чашки Петри со средой ОТДМ в центре поместили диск, пропитанный дифтерийным антитоксином (АТ). Вокруг него сформировали 5 «бляшек»: 1 и 3 – контрольный штамм С.diphtheriae gravis tох+, 2, 4 и 5 — исследованные штаммы C.diphtheriae gravis.

Чашку с посевами поместили в термостат при +37°С на 18-24 часа для предварительного учета и на 48 часов - для окончательного учета.

2

1

3

АТ

5

4

Учет

На чашке Петри со средой ОТДМ обнаружили линии преципитации между контрольным токсигенным штаммом (1, 3), исследуемым штаммом

(5) и АТ.

Между исследуемыми штаммами (2, 4) и АТ линии преципитации отсутствовали.

Заключение

На основании результатов постановки РП в геле по Элеку считаем, что выделенный от больного с подозрением на дифтерию исследуемый штамм

C.diphtheriae gravis (5) является токсигенным, штаммы C.diphtheriae gravis

(2,4) - нетоксигенны.

Протокол № 10 Методика постановки непрямого ИФА

В качестве исследуемого материала использовали образцы сыворотки трех обследованных для определения уровня антител к вирусу кори.

Для этого произвели следующие действия:

1. В лунки планшета, на которых сорбирован известный коревой антиген, внесли в объеме 100 мкл исследуемые сыворотки №1, 2, 3(в разведении 1/100), контрольную отрицательную (К-), контрольную положительную (К+) сыворотки и ЗФР в соответствии со схемой 1.

Схема 1.

Условные обозначения:

К+ - положительная контрольная сыворотка К- - отрицательная контрольная сыворотка КК – контроль конъюгата №1 – сыворотка №1 №2 - сыворотка №2 №3 - сыворотка №3

Планшеты инкубировали в термостате в течение 1 часа при +370С.

2.Произвели трехкратную промывку планшета ЗФР для удаления не связавшихся антител.

3.В каждую лунку внесли конъюгат в рабочем разведении в объеме 100 мкл и инкубировали 1 час при +370С.

4.Производили промывку планшета.

5.В каждую лунку внесли субстратно-индикаторный раствор в объеме 100 мкл и инкубировали 20 мин. в темном месте при комнатной температуре.

6.В каждую лунку внесли по 50 мкл «стоп»-реагента (5% р-р серной кислоты) для остановки ферментативной реакции.

7.Произвели визуальный и инструментальный учет результатов ИФА.

Визуальный учет (схема 2) проводили по изменению цвета реакционной смеси в лунках. При положительном результате ИФА содержимое лунок окрашивается в коричневый цвет, при отрицательном – остается прозрачным.

Инструментальный учет (схема 3) проводили с использованием приборов мультискана или ридера, измеряющих оптическую плотность в каждой лунке планшета. При положительном результате уровень оптической плотности (ОП) содержимого лунки на 0,1 ОЕ превышает ОП содержимого лунки КК.

Схема 2.

Учет ИФА (визуальный)

Заключение:

На основании результатов непрямого ИФА считаем, что у обследованного №1 обнаружены противокоревые IgM, отсутствуют противокоревые IgG, что свидетельствует об острой форме инфекции. У обследуемого № 2 обнаружены противокоревые IgG и отсутствуют противокоревые IgM, что свидетельствует о наличии постинфекционного или поствакцинального иммунитета. У обследуемого №3 специфические антитела к вирусу кори (IgM и IgG) не обнаружены, что свидетельствует об отсутствии постинфекционного или поствакцинального иммунитета.

Протокол № 11 Вирусологическая диагностика гриппа

1этап

Убольного с подозрением на грипп в первый день заболевания с помощью стерильного ватного тампона отобрали отделяемое из глубоких отделов носовой полости, предварительно очистив ее от слизи. Тампоны погрузили в пробирку с 2 мл транспортной среды и 20 мг гентамицина (для подавления бактериальной флоры). Пробирки с материалом от больного доставили в холодовом режиме (+40 С) в лабораторию, где тампоны после интенсивного встряхивания отжали, полученную жидкость отцентрифугировали и использовали для заражения 9-11-дневных куриных эмбрионов.

Для этого с помощью овоскопа определили расположение и границы воздушной камеры. Скорлупу над воздушной камерой обработали 70% этиловым спиртом, затем 2% спиртовым раствором йода, и вторично спиртом. Стерильным скарификатором сделали отверстие выше границы воздушной камеры, после чего ввели, предположительно, вируссодержащую жидкость, в объеме 0,1-0,2 мл на глубину 2-3 мм ниже границы воздушной камеры в аллантоисную полость. Отверстие в скорлупе залили расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы инкубировали в термостате 48 часов при t +36-37°C (для вирусов гриппа А) и 72 часа при t +33-34°C (для вирусов гриппа В). После инкубации эмбрионы поместили на ночь в холодильник при +40 С.

2этап

Для вскрытия зараженных куриных эмбрионов поверхность скорлупы над воздушной камерой обработали спиртом и йодом. Затем скорлупу рассекли ножницами выше очерченной карандашом границы воздушной камеры. Отбросив скорлупу, отметили зоны поражения эмбриона – геморрагии, белесоватые очаги. Пастеровской пипеткой проколи хорионаллантоисную оболочку и отобрали аллантоисную жидкость.

Для индикации (обнаружения) вируса произвели постановку реакции гемагглютинации (РГА) в полистироловом планшете с аллантоисной жидкостью и 0,5% нативными куриными эритроцитами (Схема 1).

дез.р-р

Условные обозначения:

«++++» - склеивание эритроцитов в виде «зонтика» «-» - выпадение эритроцитов в осадок в виде «пуговки»

Титр вируса в РГА составил 1:160, что соответствует 1 гемагглютинирующей единице (ГАЕ) вируса. Положительная РГА указывает на присутствие вируса гриппа в исследуемом материале.

Для идентификации выделенного вируса постановили реакцию торможения гемагглютинации (РТГА). Для этого использовали вируссодержащую жидкость в разведении 1/20, соответствующем 8 ГАЕ, и типоспецифические противогриппозные сыворотки типов А(H1N1), А(H2N2), А(H3N2) и типа В (Схема 2).

Заключение:

На основании полученных результатов установлено, что из отделяемого носовой полости больного с подозрением на грипп, выделен вирус гриппа типа A(H3N2).

Протокол № 12 Вирусологическое исследование фекалий больного с подозрением на

полиомиелит

1этап

Убольного с подозрением на полиомиелит в качестве исследуемого материала взяли две пробы фекалий в объеме 8-10г. Первая проба отобрана на 7 день заболевания, вторая - через 24-48 ч. Пробы обработали хлороформом для удаления бактериальной и грибковой микрофлоры, а также разъединения вирусных агрегатов. Затем приготовили их них 20% фекальную суспензию с использованием фосфатно-буферного солевого раствора с антибиотиками (смесь пенициллина и стрептомицина).

Произвели заражение 20% фекальной суспензией двух перевиваемых линий культур клеток (рабдомиосаркомы человека (RD) и мышиных клеток (L20B)) для повышения чувствительности и специфичности выявления полиовируса. В качестве отрицательного контроля использовали интактные (не зараженные) культуры клеток RDиL20В.

Перед заражением культуры клеток просматривали при малом увеличении в затемненном поле зрения для проверки качества монослоя клеток. Наблюдали неизмененные клетки полигональной формы, плотно прилегающие друг к другу, равномерно устилающие поверхность.

В пробирки с клетками обеих линий внесли одновременно по 0,2 мл 20% фекальной суспензии и инкубировали при +360С в течение 7 дней, ежедневно, микроскопируя для обнаружения цитопатического действия

(ЦПД).

2этап

На 5 день культивирования обнаружили ЦПД, проявившееся нарушением монослоя клеток, изменением их формы, отслаиванием от поверхности. Для выделения вируса произвели замораживание и оттаивание культур клеток с последующим отбором вируссодержащей жидкости.

Идентификацию выделенных штаммов полиовирусов проводили в реакции нейтрализации на культуре клеток микрометодом. Для этого вирусную суспензию и диагностические сыворотки против полиовирусов I, II и III типов смешивали в лунках планшета в объеме 0,05 мл. Планшеты инкубировали 1ч при +360С. Затем в каждую лунку добавили по 0,05 мл суспензии клеток RD и L20B. В качестве контроля использовали интактную культуру клеток. Планшеты поместили в термостат на 5 суток, ежедневно микроскопируя для обнаружения ЦПД.

3 этап

Учет реакции нейтрализации:

- вирус+сыворотка против вируса полиомиелита типа I- ЦПД,

-вирус+сыворотка против вируса полиомиелита тип IIмонослой клеток,

-вирус +сыворотка против вируса полиомиелита тип IIIЦПД,

-интактная культура клеток – монослой клеток.

Для внутритиповой дифференциации выделенного штамма полиовируса (дикий или вакцинный) поставили ИФА с использованием и ПЦР в течение 14 дней от момента выделения и идентификации штамма. Результаты ИФА и ПЦР показали, что выделенный штамм полиовируса является диким.

Заключение

На основании полученных результатов установлено, что из фекалий больного с подозрением на полиомиелит выделен вирус полиомиелита типа II (дикий).