11. Особенности стадии выделения и очистки в зависимости от целевого продукта. Продукты микробного брожения и метаболизма.

     Стадия  выделения продукта существенно  зависит от того, накапливается продукт  в клетках или он выделяется в  культуральную жидкость, или же продуктом является сама клеточная масса. Разделение биомассы и культуральной жидкости - сепарация - осуществляется несколькими методами. Если целевым продуктом является биомасса клеток, применяют следующие методы выделения: отстаивание, фильтрация, флотирование, сепарирование и т.д. (механические способы); выпаривание и сушка (физические способы).

     К физическим методам можно отнести разрушение клеток под действие ультразвука, замораживания-оттаивания, баллистическую дезинтеграцию. Баллистическая дезинтеграция клеток осуществляется в мельницах, куда помещают суспензию клеток и вспомогательные мелющие вещества: песок, стеклянные или полимерные шарики.

     К химическим методам дезинтеграции относят разрушение клеток с помощью толуола, бутанола и других химических соединений.

     При использовании ферментативной дезинтеграции клеток используют ферменты, способные разрушать определенные структурные компоненты клеточных стенок микроорганизмов

12. Направленный синтез лимонной кислоты.

Синтез лимонной кислоты связан с циклом дикарбоновых кислот и происходит в результате конденсации какой-либо кислоты, содержащей четыре атома углерода и две карбоксильные группы, с кислотой, имеющей два атома углерода и одну карбоксильную группу. Химизм образования лимонной кислоты представлен на рис. 4.1. В результате гликолиза глюкозы образуется пировиноградная кислота. На следующем этапе происходит ферментативное связывание пировиноградной кислоты с диоксидом углерода. Образовавшаяся щавелевоуксусная кислота вступает далее в реакцию с уксусной кислотой и образуется лимонная кислота. Таким образом, химизм образования лимонной кислоты включает реакции гликолиза и ряд реакций, замкнутых в цикл Кребса. При каждом обороте этого цикла молекула щавелевоуксусной кислоты вступает во взаимодействие с молекулой уксусной кислоты, образуя лимонную кислоту.

13. Получение молочной кислоты биотехнологическим способом.

Молочная кислота (СН3СНОНСООН) – органическая одноосновная кислота, образующаяся в результате анаэробного превращения углеводов молочнокислыми бактериями. Данную кислоту применяют в пищевом (напитки, мармелады, консервирование), химическом (пластмассы, красители, лаки) и фармацевтическом производствах. В 1847 г. С. Блодно доказал, что данная кислота является продуктом брожения. Образование молочной кислоты из глюкозы возможно двумя путями:  при ее сбраживании гомоферментными молочнокислыми бактериями;  гетероферментный путь включает распад глюкозы до пировиноградной кислоты и ее восстановление до молочной кислоты. В биотехнологическом производстве молочной кислоты используют гомоферментные молочнокислые бактерии, чаще бактерии рода Bacterium delbruckii (син. Lactobacillus delbruckii). У них только 3% субстрата превращается в клеточный материал, а остальной – трансформируется в молочную кислоту, выход которой достигает 1,5%. Теоретически из 1 моля глюкозы должно образоваться 2 моля лактата. На практике эта величина ниже, 1,8 моля, т.е. выход продукта от субстрата составляет 90%. Вначале имеет место гликолиз (рис. 3), затем пировиноградная кислота восстанавливается с помощью лактатдегидрогеназы. Рис. 3. Схема биосинтеза молочной кислоты Молочнокислое брожение протекает в анаэробных условиях. Однако, лактобациллы относятся к факультативным анаэробам, поэтому в процессе ферментации воздух полностью из ферментеров не удаляют. В качестве сырья используют сахарную и тростниковую мелассу, гидролизаты крахмала. При этом концентрация сахаров в среде в зависимости от характера брожения составляет 5–20%. Используют восстановленные формы азота, сульфаты или фосфаты аммония, а также солод и кукурузный экстракт в качестве факторов роста. Ферментацию проводят в глубинной культуре при значениях рН 6,3–6,5 и температуры 48–50 С. Продолжительность процесса составляет 7–11 суток. В ходе брожения для коррекции изменяющейся величины рН в среду вносят мел (3–4 раза в сутки). Конечная концентрация образующегося лактата кальция составляет 10–15%, остаточная концентрация сахаров – 0,5–0,7%. На постферментационной стадии культуральную среду нагревают до температуры 80–90 С и нейтрализуют гашеной известью до слабощелочной реакции. После отстаивания в течение 3–5 ч взвешенные частицы декантируют. Затем раствор лактата кальция подают на фильтр-пресс. Фильтрат упаривают до концентрации 27–30%, охлаждают до температуры 25–30 С и выдерживают в кристаллизаторах в течение 36–48 ч. Промытый лактат кальция отделяют центрифугированием и подвергают расщеплению серной кислотой при температуре 60–70 С. Сырую молочную кислоту 18–20% концентрации упаривают в несколько этапов в вакуум-выпарных аппаратах до 70% концентрации. Кислоту после фильтр-пресса подают на розлив с внесением небольших количеств мела. При этом около 10% кислоты превращается в кристаллический лактат, связывающий молочную кислоту. Для отделения ионов железа сырец молочной кислоты при температуре 65 °С обрабатывают желтой кровяной солью (выпадает берлинская лазурь), а тяжелые металлы осаждают сульфатом натрия. Для адсорбции красящих веществ используют уголь активированный, затем фильтруют под давлением 800–920 кПа. Молочную кислоту дополнительно еще раз обрабатывают углем активированным, фильтрую и фасуют.