51. Методы и приемы получения биологически активных соединений и биопрепаратов.

Методы извлечения БАВ из растительного сырья являются основным вопросом при разработке и изготовлении БАД к пище на основе растительного сырья. От реализации отработанной технологии зависит количество извлекаемых из сырья БАВ и их состав, себестоимость полученной субстанции и соответственно изготовленного на ее основе препарата.

Экстракция БАВ из сухого растительного сырья осуществляется водно-спиртовым раствором, водой, углекислотой, фреоном и рядом других экстрагентов. Различные экстрагенты используются для извлечения различных групп веществ.

Так, для извлечения флавоноидов и алкалоидов используется водно-спиртовый раствор. Для извлечения жирорастворимых компонентов используются неполярные экстрагенты (углекислота, фреон, масла). Основная часть сухого растительного сырья экстрагируется в промышленности водно-спиртовой смесью. Водные экстракты из растительного сырья имели ограниченное применение из-за невысокой устойчивости водных растворов БАВ к различным воздействиям (микробиологическим, окислительным и др.).

При разработке методов водного извлечения БАВ для конкретного сырья обязательным условием является обеспечение условий интенсивной и кратковременной экстракции в безокислительных условиях. Надо увеличить образуемые при сушке сырья поры в мембране клетки или нарушение ее целостности. Основным приемом стабилизации экстрактов является их концентрирование. Густые экстракты стерилизуются в скребковых стерилизаторах для использования в приготовлении некоторых форм БАД или используются как сырье для получения сухих экстрактов в вакуумных сушилках барабанного типа.

Субстанции из свежего сырья. При сушке растительного сырья 15-25% БАВ разрушается. Клетки свежего сырья обладают значительным тургором, механическими нагрузками сравнительно легко разрушается оболочка клетки, водой «вымывается» ее содержимое. Это так называемая диффузионная экстракция. Такая экстракция обеспечивает не только более полное извлечение БАВ, но в значительной степени позволяет сохранить природный комплекс биологически активных веществ. Полученный экстракт концентрируется и стерилизуется. При реализации технологии существенную роль играет способ деструкции сырого сырья, организация механических воздействий на сырье таким образом, чтобы разрушить оболочку клетки, но не измельчать сырье до микронных размеров. При тонком измельчении возникает не только проблема отделения экстракта от шрота, но значительно усложняется вакуумная концентрация экстрактов, содержащих тонко измельченную клетчатку, вследствие повышенной вязкости экстракта и его малой теплопроводности. Извлечение БАВ из свежего растительного сырья не является тривиальной задачей и решается для каждого вида сырья с оптимизацией расходов на субстанцию.

Вакуумное концентрирование экстрактов осуществляется на разработанных вакуумных выпарных аппаратах с возможностью оперативного отбора концентрата и контроля содержания сухих веществ. Пять выпарных аппаратов с общей производительностью около 2 тонн выпаренной влаги в час позволяют оперативно настраиваться на объемы получаемых экстрактов и осуществлять одновременно концентрацию экстрактов различных видов сырья.

Стерилизация густых экстрактов. Для густых концентратов, обладающих низкой теплопроводностью и наоборот большой вязкостью пригодны только скребковые стерилизаторы. Густые экстракты различных видов сырья значительно отличаются по своим физико-химическим свойствам и режимы их стерилизации заметно отличаются. Скребковый стерилизатор позволяет регулировать скорость подачи и температуру пара в теплообменнике, скорость вращения скребков и объем подаваемого в стерилизатор густого экстракта.

Сухие экстракты получаются в вакуумных сушилках барабанного типа совмещенной с шаровой мельницей с объемом загрузки 200-300 литров густого экстракта.

Из органоминерального сырья биологически активные вещества извлекаются сложными многокомпонентными экстрагентами. Подготовка сырья, экстрагента и его рекуперация не относятся к тривиальным операциям. В то же время от подготовки сырья и соотношения компонент экстрагента зависит не только количество, но и качество извлекаемых веществ 

В России биопрепаратами называют препараты, полученные на основе штаммов микроорганизмов, имеющих разрешения санитарно-эпидемиологических служб на их производство и применение. Подавляющее большинство этих штаммов прототрофные, природного происхождения, т. е. не относятся к генетически модифицированным и не содержат мутаций, требующих дополнительных источников ростовых факторов.

Товарной формой препаратов могут быть сухой порошок и жидкая концентрированная суспензия клеток. Технология получения сухих товарных форм биопрепаратов и используемое технологическое оборудование типичны для биотехнологических процессов получения биомассы живых клеток микроорганизмов (например, при выпуске пекарских дрожжей, микробиологических средств защиты растений и т. д.). Технология включает следующие стадии:

* прием, хранение и подготовка сырья, органического субстрата, растворов минеральных солей;

* обеспечение ферментационного процесса источником кислорода, технологической водой, паром, моющими и дезинфицирующими средствами, пеногасителями;

* выращивание посевного материала;

* накопление биомассы в рабочем аппарате - ферментере;

* концентрирование суспензии микроорганизмов сепарацией, микрофильтрацией, адсорбцией на инертных материалах-наполнителях;

* сушка (при выпуске жидких форм препаратов стадия сушки отсутствует);

* если предусмотрено, гранулирование, компаундирование препарата с различными наполнителями и внесение добавок;

* расфасовка, упаковка, складирование, отправка готового продукта;

* очистка сточных вод, газовоздушных выбросов со стадии ферментации, сепарации и сушки.

На стадии ферментации микроорганизмы культивируют периодическим или непрерывным способом, на питательных субстратах и при режимах, гарантирующих получение микроорганизмов с необходимыми свойствами или активностью ферментов, участвующих в удалении загрязнений. При использовании таких субстратов, как углеводороды, биодоступные аналоги ксенобиотиков (например, нехлорированные аналоги хлорсодержащих соединений) возможно культивирование в не строго асептических условиях, что существенно упрощает требования к технологическому обеспечению ферментационного процесса и квалификации обслуживающего персонала.

При концентрировании биомассы и сушке используются методы и технологические режимы, обеспечивающие сохранение жизнеспособных клеток микроорганизмов, что особенно важно при получении биопрепаратов на основе неспоровых форм микроорганизмов. В частности, сепараторы и циркуляционные контуры мембранных установок оснащаются рубашкой для охлаждения суспензии, что позволяет в процессе сепарирования поддерживать температуру ниже температуры инактивации клеток микроорганизмов, для сушки применяют распылительные, лиофильные или вакуум-термические сушилки.

При получении иммобилизованных биопрепаратов суспензию клеток микроорганизмов (обычно до стадии концентрирования) смешивают с носителем (сорбентом). Носитель может быть порошкообразным, гранулированным, волокнистым, тканым. Процедура иммобилизации может предусматривать внесение дополнительных реагентов, флокуляцию, осаждение клеток на носителе и другие приемы, повышающие эффективность иммобилизации. В процессе созревания, длящемся от 2-3 недель до 1,5-2 месяцев, биомасса микроорганизмов-деструкторов нарастает на носителе, увеличиваются титр жизнеспособных клеток, их активность и срок хранения препарата.

Внесение различных добавок (наполнителей, осмопротекторов и других защитных веществ, компонентов питания и т. п.) в полученную биомассу позволяет исключить из технологической схемы стадию сушки, инактивирующую клетки микроорганизмов, стандартизировать характеристики биопрепарата, увеличить срок хранения, выживаемость и активность микроорганизмов, эмульгирующую, диспергирующую, адгезионную, пенообразующую способности, уменьшить слеживаемость.

Сухие товарные формы биопрепаратов могут храниться до 6 месяцев и более без существенного снижения их целевых свойств. Срок хранения жидких препаратов существенно ниже. Однако исходный титр жизнеспособных клеток в них может быть больше, а стоимость ниже, так как из технологии получения исключена стадия сушки, приводящая к инактивации части клеток.

Задачей разработки технологии применения биопрепаратов является обеспечение необходимых условий (содержание минеральных компонентов, дополнительных субстратов, мелиорантов, наполнителей и других добавок, оптимальные условия влажности, температуры, рН среды, аэрации и др.) для активного развития микроорганизмов биопрепарата в загрязненной среде, использования их биоокислительного потенциала.

Для активации микроорганизмов биопрепаратов (восстановления сниженной жизнеспособности клеток, индукции и повышения активности деструкционных ферментов) перед использованием рекомендуется препараты разводить в водной среде, содержащей питательные компоненты и, возможно, загрязняющее вещество, и выдерживать некоторое время (от нескольких часов до суток), если требуется, при аэрировании.

Можно рассмотреть производства Субъединичные вакцины. Для создания субъединичных вакцин используют три метода.

Первый метод — получение большого количества вирусов, очистка и выделение иммуногенных субъединиц; это так называемые сплит-вакцины. Однако этот способ является дорогостоящим, и он вряд ли найдет когда-либо промышленное применение.

Второй метод — химический синтез специфического иммуногена. При его использовании необходимо знание структуры и аминокислотного состава антигенных детерминант. Детерминантные участки, которые включают в себя только несколько аминокислот, могут быть синтезированы химически и соединены с белком-носителем, таким, как бычий сывороточный альбумин; затем сцепленный белок используют в качестве вакцины. К сожалению, это требует технологически сложного пептидного синтеза.

Третий метод — рекомбинантный.

Генно-инженерные вакцины. Рекомбинантные вакцины получают с помощью биотехнологии. Их изготовление — новое направление в создании генно-инженерных противовирусных вакцин, суть которого состоит во введении в геном крупных вирусов генов протективных белков (противовирусных). В качестве продуцента протективного антигена вируса наиболее часто используют кишечную палочку. В плазмиду кишечной палочки «встраивают» ген вируса, ответственный за синтез протективного антигена. Полученную кишечную палочку культивируют в реакторах, которые синтезируют полипептид вируса. Из бактериальной культуры полипептид вируса выделяют методом молекулярной биологии.

Субъединичные вакцины обладают значительными преимуществами по сравнению с традиционными препаратами: они безопасны, так как не содержат вируса, способного вызвать заражение, свободны от вредных примесей, стабильны и не требуют хранения в рефрижераторах. Однако сегодня их главный недостаток - слабые иммуногенные свойства. Для этой цели ведется поиск новых адъювантов и иммуностимуляторов.

Производство биопрепаратов осуществляется на технологических линиях производства противобактерийных, противовирусных, диагностических препаратов, сывороток, глобулинов, пробиотиков, антибиотиков.