2. Просмотр характера и массивности роста

"Подозрительные" колонии на кровяно-теллуритовых средах через 24 ч роста - темно-серого или серо-черного цвета, выпуклые, округлой формы, непрозрачные, с ровными краями, мягкой, маслянистой консистенции; через 48 ч окончательно формируется типичная морфология (архитектоника) колоний - серо-черного или черного цвета с металлическим оттенком, непрозрачные, матовые, приподнятые с выпуклым центром или выпуклые, округлой формы, гладкие с ровными краями и мягкой консистенции (S-форма) или шероховатые, с радиальной исчерченностью (напоминающие форму "маргаритки"), с приподнятым центром (R-форма).

3. Пересев типичных колоний на элективную среду Леффлера (получение чистой культуры), на сывороточный мясо-пептонный агар для определения токсигенности, постановка пробы на цистиназу

Идентификация

1. Микроскопирование – мазок, окраска по Граму (грамположительная), Нейсеру биполярно расположенные темно-синие, почти черные, включения волютина и располагаются в виде римских цифр V или Х

2. Токсигенность - с помощью реакции преципитации в геле - При наличии токсигенности в местах соединения ток­сина с антитоксическими антителами в питательной среде образуются белые линии преципитата, напоминающие усики.Так же определяют с помощью ИФА и ПЦР.

3. Биохимические свойства – проба на цистиназу - определяют путем посева методом укола петли исследуемой культуры на цистиновый МПА с азотнокислым свинцом (проба Пизу) При наличии цистиназы в среде образуется почернение (образование сульфида свинца) по ходу укола Коринебактерии дифтерии ферментируют глюкозу, мальтозу. Отсутствие активности в отношении сахарозы и мочевины - важный дифференциальный признак среди дифтероидов.

4. Антигенная характеристика - У Corynebacterium diphtheriae выделяют О- и К- антигены ( Аг ). Липидные и полисахаридные термолабильные фракции О-антигена ( Аг ) коринебактерий преимущественно представлены межвидовыми антигенами ( Аг ).

5. Фаготипирование – для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 коринефагов

6. Чувствительность к антибиотикам – стандартный метод дисков

7. Заключение

Серологический метод –РА, РНГА с целью определения антител в парных сыворотках крови больных дифтерией.

Экспресс-диагностика ИФА (за 18 часов)

Молекулярно-генетический метод-ПЦР

8. В природном очаге отмечено несколько случаев заболевания людей с подозрением на бубонную форму чумы. У одного из заболевших проведены бактериоскопия содержимого бубона и посев на мясо-петонный агар для выделения чистой культуры. В мазке, окрашенным метиленовым синим, обнаружены мелкие овоидные, биполярно окрашенные палочки. После суточного инкубирования посева рост на питательной среде не отмечался. Для подтверждения диагноза была взята кровь больного и проведена биологическая проба, сделан мазок-отпечаток из органов животного. Результат микроскопии при окраске метиленовым синим: синего цвета овоидные, биполярно окрашенные мелкие палочки на фоне клеток ткани животного. Перечислите микробиологические методы, подтверждающие этиологию заболевания.

возбудитель Y.pestis

Бактериоскопия – окраска метиленовым синим, мелкие овоидные, биполярно окрашенные палочки. При окраске по Граму будут наблюдаться

2) Бактериологический метод:

А) Посев на МПБ, кровяной МПА с антифаговой сывороткой и сульфатом натрия. Инкубирование 48 часов при 25-28С.

Образуются колонии в R-форме, которые имеют форму «кружевных платочков», со светлым центром(плотный,компактный) и фестончатыми краями. В случае приведенном в задаче, рост не отмечался так как не была введена антифаговая сыворотка.

Пресев культуры на скошенный МПА для накопления чистой культуры.

3) Идентификация

Микроскопирование – окраска по Граму, биполярно ок¬рашенные грамотрицательные овоидные клетки

Биохимические свойства – восстанав¬ливает нитраты в нитриты, ферментирует глюкозу, ксилозу, маннит с образованием кисло¬ты (без газа), не обладают уреазной активностью, плазмокоагулаза положительна, не разжижает желатин.

Фаготипирование – провести невозможно

Антигенная характеристика –. Имеет термостабильные 0-антигены и термолабильные капсульные антигены. Протективной активностью обладает F1-антиген. Т-антиген (мышиный токсин).

Чувствительность к антибиотикам – метод серийных разведений в бульоне, изучена чувствительность к стрептомицину, хлорамфениколу, эритромицину, гентамицину, ципрофлоксацину, рифампицину, азитромицину.

Диско-диффузионный метод

Биопроба – на морских свинках и белых мышах с последующим мазком-отпечатком из органов животного - результат микроскопии при окраске метиленовым синим: синего цвета овоидные, биполярно окрашенные мелкие палочки на фоне клеток ткани животного. Животных заражают внутрибрюшно, подкожно или внутрикожно . Животное погибает на 3-9 день после инфицирования.

Так же для уточнения этиологии заболевания можно использовать:

Серологическое исследование РНГА с эритроцитами, на которых адсорбирован капсульный антиген возбудителя чумы, реакцию нейт¬рализации антигена (РНАг), ИФА и непрямую РИФ. Диагностический титр 1:40 и выше

В качестве аллергического метода диагностики проводят кожную пробу с пестином.

Экспресс-диагностика – РИФ, позволяет получить результат через 2 часа.

9. При поступлении пациента в приемное отделение врач отметил у больного сухой кашель, увеличение печени и подмышечных узлов, которые были малоболезненны и имели четкие контуры. Был поставлен предварительный диагноз туляремия (?). Однако при посеве содержимого бубона на желточную среду Мак-Коя чистую культуру Francisella tularensis выделить не удалось. Можно ли исключить туляремию? Составить алгоритм микробиологического исследования материала.

Туляремию исключить нельзя, так как Francisella tularensis не дает роста сразу на питательных средах, для данного возбудителя необходимо провести культивирование на биологическом объекте

Алгоритм

1. Биологический метод – заражают белых мышей подкожно, морских свинок внутрибрюшно или 12 дневные куриные эмбрионы в желточный мешок. Животные погибают на 3-6 день.

2. Бактериологический метод

- Выделяют чистую культуру из органов делая мазки-отпечатки на плотные питательные среды (желточная, глюкозоцистеиновый кровяной агар, среда Емельянова и тд), так же проводится окрашивание мазков по Романовскому-Гимзе – сиреневый цвет, мелкие кокковидные и палочковидные бактерии, которые располагаются внутриклеточно и в виде скоплений, образуя нежную капсулу

- Культивирование посевов при 37 градусах 3-20 дней.

- Учет характера роста

На желточной среде Мак-Коя мелкие, выпуклые, бесцветные с перламутровым блеском колонии S формы

- Пересев на скошенный глюкозо - цистиновый агар для выделения чистой культуры

- На 12-23 дни происходит пересев на среды пестрого ряда

Индикация: