28 Иммунофлуоресцентный метод (прямой и непрямой) диагностики инфекционных бо­лезней. Сущность метода, его преимущества и недостатки.

Реакция иммунофлуоресценции. Молекулы иммуноглобулинов способны необратимо связываться (метиться) с некоторыми химическими веществами без потери своей антительной специ­фичности и свойства связываться с антигеном. Для такого мечения можно ис­пользовать красители, флуоресцирующие при облучении их коротковолновым светом (ультрафиолетовым, фиолетовым, синим), например изотиоционат флуо- ресцеина, дающий зеленовато-желтое окрашивание, или другие флуорохромы. Использование для обнаружения антигенов меченных флуорохромами антител, т. е. реакцию иммунофлуоресценции (РИФ), предложил в 1950 г. А. Куне. С по­мощью РИФ можно быстро обнаруживать даже ничтожные количества антиге­нов, в том числе бактериальных и вирусных, по эффекту флуоресценции ком­плекса антиген + антитело в люминесцентном микроскопе.

Метод иммунофлуоресценции используют в двух вариантах. Один из них полу­чил название прямого метода РИФ, и в этом случае метят антитела, которые не­посредственно участвуют в реакции с исследуемым антигеном. Второй вариант известен под названием непрямого метода РИФ. В этом случае с исследуемым антигеном вначале взаимодействуют специфические к нему антитела, а уже с ни­ми взаимодействуют антивидовые антитела (антитела против иммуноглобули­нов диагностической сыворотки), меченные флуорохромом (рис. 74). Преиму­ществом непрямого метода РИФ является то, что при его использовании отпадает необходимость иметь большой набор различных специфических флуоресцирую­щих антител, так как он основан на использовании антиглобулиновых антител. В качестве последних обычно используют сыворотку козы или барана, иммунизи­рованных сывороткой кролика (коммерческие диагностические иммунные сыворотки чаще всего готовят путем иммунизации кроликов). Непрямой метод иммунофлуо­ресценции применяют не только для ускоренного обнаружения антигенов (воз­будителя), но и для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Напри­мер, для серологической диагностики токсоплазмоза токсоплазмы фиксируют на предметном стекле и обрабатывают сывороткой исследуемого больного. После ее отмывки мазок повторно обрабатывают сывороткой, содержащей меченные флуорохромом антитела против человеческого глобулина. Если в крови больно­го есть антитела, т. е. человек болен, в люминесцентный микроскоп будут видны светящиеся токсоплазмы.

29. Реакция пассивной гемагглютинации, механизм протекания и ее практическое применение.

Классическая реакция агглютинации предусматривает использование корпуску­лярных антигенов. Однако в ней могут участвовать и растворимые антигены. Чтобы это стало возможным, такие антигены адсорбируют на иммунологически инертных частицах. В качестве носителя можно использовать частицы латекса или бентонита, однако в настоящее время наиболее часто применяют эритроциты животных или че­ловека, улучшая их адсорбирующие свойства обработкой растворами танина, фор­малина или бензидина. Эритроциты, адсорбировавшие на себе антиген, называются сенсибилизированными данным антигеном, а иммунная реакция, в которой они уча­ствуют, — реакцией непрямой, или пассивной, гемагглютинации (РНГА, или РПГА), так как эритроциты участвуют в ней пассивно.

РПГА ставят в специальных полистироловых пластинках с луночками, имею­щими полусферическое дно. При использовании ее для серологической диагности­ки в этих луночках готовят двукратные разведения в физиологическом растворе исследуемой сыворотки и затем добавляют к ней в качестве диагностикума взвесь сенсибилизированных эритроцитов. Учет результатов проводят через 2 ч инкубации при температуре 37 °С по четырехкрестной системе. При положительной реакции агглютинировавшиеся эритроциты оседают на дно луночки и равномерно покры­вают его в виде перевернутого зонтика. При отрицательной реакции эритроциты тоже оседают, жидкость становится прозрачной, осадок выглядит как маленький диск в центре луночки. Титром сыворотки в РПГА считается последнее ее разведение, которое еще дает ярко выраженную гемагглютинацию без значительных призна­ков наличия диска.

РПГА может применяться также в качестве ускоренного метода бактериологиче­ской диагностики для обнаружения непосредственно в исследуемом материале неиз­вестных бактерий, вирусов, токсинов, например возбудителей чумы, стафилококко­вых энтеротоксинов и др. При таком варианте постановки РПГА в роли известного компонента реакции используют эритроциты, адсорбировавшие антитела известной специфичности — антительный эритроцитарный диагностикум. Если исследуемый материал содержит достаточное количество известного антигена, РПГА будет поло­жительна.

Вариантами использования РПГА являются: реакция нейтрализации антигена (РНАг), реакция нейтрализации антител (РНАт), реакция торможения пассив­ной гемагглютинации (РТПГА). Для этих реакций используют антигенные и ан­тительные эритроцитарные диагностикумы. Можно использовать одновременно две взаимно контролирующие однонаправленные реакции, например РПГА с ан­тигенным диагностикумом и РНАг с антительным эритроцитарным диагностикумом.

Реакция нейтрализации антител (РНАт) заключается в том, что суспензию, со­держащую искомый антиген, смешивают со специфической иммунной сывороткой, содержащей известные антитела, в соответствующих объемах и инкубируют при температуре 37 °С в течение двух часов. После этого добавляют антигенный эрит­роцитарный диагностикум. Смесь встряхивают и оставляют при комнатной темпера­туре. Результаты учитывают через 3—4 ч и окончательно — через 18—24 ч. Если в исследуемом материале имеется антиген, он свяжет антитела (нейтрализует их), и по­этому гемагглютинации не произойдет.

По такому же принципу ставят реакцию нейтрализации антигена (РНАг). Только в этом случае в исследуемом материале обнаруживают антитела. Специфический ан­тиген, добавленный к такому исследуемому материалу, будет связываться с антите­лами, содержащимися в нем, т. е. произойдет нейтрализация антигена антителами, и поэтому гемагглютинации при добавлении антительного эритроцитарного диа- гностикума не произойдет.

30. Агглютинины и реакция агглютинации. 0- и Н-агглютинация бактерий. Механизм реакции агглютинации. Получение агглютинирующих сывороток. Методика поста­новки и оценки результатов развернутой реакции агглютинации.

Реакция агглютинации

Агглютинация (лат. а^ЫЫпаНо — склеивание) - склеивание (соединение) антигеннесущих корпускулярных частиц (цельные клетки, частицы латекса и др.) молекулами специфических антител в присутствии электролитов, которое закан­чивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (аг- глютината). Характер осадка зависит от природы антигена: жгутиковые бактерии дают крупнохлопьевидный осадок, безжгутиковые и бескапсульные — мелкозер­нистый, капсульные — тяжистый. Различают агглютинацию прямую, при кото­рой во взаимодействии со специфическими антителами непосредственно участву­ют собственные антигены бактериальной или любой другой клетки, например эритроцитов; и непрямую, или пассивную, при которой бактериальные клетки или эритроциты, или частицы латекса являются носителями не собственных, а сорбированных на них чужих антигенов (или антител) для выявления специ­фических к ним антител (или антигенов). В реакции агглютинации участвуют главным образом антитела, относящиеся к классам IgG и IgМ. Она протекает в две фазы: вначале происходит специфическое взаимодействие активного цент­ра антител с детерминантом антигена, эта стадия может происходить в отсут­ствие электролитов и не сопровождается видимыми изменениями реагирующей си­стемы. Для второй стадии — образования агглютината — необходимо наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комплексов антиген + ан­титело и ускоряют процесс их склеивания. Эта фаза заканчивается образованием агглютината.

Реакции агглютинации ставят либо на стеклянных, либо на гладких картонных пластинках, либо в стерильных агглютинационных пробирках. Реакции агглюти­нации (прямые и пассивные) на стекле обычно применяют в качестве ускоренно­го метода обнаружения специфических антител в сыворотке больного (например, при бруцеллезе) или для серологической идентификации возбудителя. В послед­нем случае обычно используют хорошо очищенные (адсорбированные) диагнос­тические сыворотки, содержащие только монорецепторные антитела или их на­бор к различным антигенам. Несомненным достоинством реакции агглютинации на стекле является простота ее постановки и то, что она протекает несколько ми­нут или даже секунд, так как оба компонента в ней используются в концентриро­ванном виде. Однако она имеет лишь качественное значение и менее чувствитель­на, чем пробирочная. Развернутая реакция агглютинации в пробирках дает более точные результаты, ибо она позволяет определить количественное содержание антител в сыворотке (установить ее титр) и при необходимости зарегистрировать факт нарастания титра антител, что имеет диагностическое значение. Для поста­новки реакции в агглютинационные пробирки вносят определенным образом разведенную 0,85 % раствором NaС1 сыворотку и равный объем (обычно 0,5 мл) суспензии стандартного диагностикума (или исследуемой культуры), содержаще­го в 1 мл 1 млрд бактерий. Учет результатов реакции агглютинации производят предварительно через 2 ч инкубации пробирок при температуре 37 °С и оконча­тельно через 20—24 ч по двум признакам: наличию и величине осадка и степени прозрачности надосадочной жидкости. Оценку осуществляют по четырехкрест- ной системе. Реакция обязательно сопровождается контролем сыворотки и антиге­на. В тех случаях, когда развернутую реакцию агглютинации в пробирке ставят для серологической идентификации возбудителя, она имеет диагностическое зна­чение, если реакция оценена как положительная при разведении диагностической сыворотки не менее половины ее титра.

Необходимо учесть, что при смешивании растворов гомологичных антигенов и антител не всегда наблюдаются видимые проявления реакции агглютинации. Осадок образуется только при некоторых оптимальных соотношениях обоих компонентов реакции. Вне этих пределов, при значительном избытке антигена или антител, реакции не наблюдается. Это явление получило название «феномена прозоны». Оно наблюдается как при реакции агглютинации, так и при реакции преципитации. Появление прозоны в иммунных реакциях объясняется тем, что участвующие в них антигены, как правило, являются полидетерминантными, а мо­лекулы антител IgG имеют два активных центра. При избытке антител поверх­ность каждой частицы антигена покрывается молекулами антител так, что не остается свободных детерминантных групп, поэтому второй, несвязанный активный центр антител не может взаимодействовать с другой антигенной частицей и связывать их друг с другом. Образование видимого агглютината или преципитата подав­ляется также при избытке антигена, когда не остается ни одного свободного актив­ного центра антител, и поэтому комплексы антиген + антитело + антиген не могут более укрупняться.

31. Преципитирующие свойства иммунных сывороток. Использование преципитации в агаре и применение ее для изучения- антигенов и определения токсигенности дифтерийной палочки.Реакция преципитации и ее варианты

Реакции агглютинации и преципитации очень близки по своей сути. Различия между ними зависят главным образом от величины частиц антигена. Преципитаци­ей называют процесс, когда происходит агрегация антител с растворимыми антиге­нами; если же антиген представлен корпускулами, специфическая агрегация таких антигенов описывается как агглютинация.

Появление преципитата при реакции антиген—антитело определяется не только возникновением решетки, образуемой ее участниками, но и особой ро­лью Fс-фрагмента иммуноглобулина, изменение конформации которого приво­дит к утрате этим комплексом растворимости в солевых растворах. В связи с этим в реакции преципитации используют неразведенную или слабо разведен­ную сыворотку.

Для постановки реакции преципитации необходимы: антитела — испытуемая сы­воротка больного или иммунная диагностическая сыворотка (при идентификации выделенных микробов); антиген — экстрагированный гаптен или полный гаптен со­ответствующих микроорганизмов; физиологический раствор как источник электро­литов. Существует множество модификаций этой реакции, которые подразделяют на две группы: преципитация в жидкой среде (реакция флоккуляции и реакция коль- цепреципитации) и преципитация в геле.

Реакция флоккуляции представляет собой преципитацию, при которой рас­творы антигенов и антител смешивают в пробирке. Учет реакции производят с по­мощью измерения на фотоэлектроколориметре мутности получаемой системы, что позволяет определить концентрацию исследуемого антигена.

Значительно чаще применяется качественная реакция кольцепреципитации. Для ее постановки в тонкие преципитационные пробирки наливают сначала неразведенную преципитирующую сыворотку и сверху на нее наслаивают, не до­пуская перемешивания, раствор антигена. В случае гомологичности антител и ан­тигена на границе между этими растворами быстро, через 3—10 мин, появляется кольцо преципитата. В отличие от реакции агглютинации, титр преципитирующей сыворотки определяют с помощью разведения не сыворотки, а антигена.

Реакция преципитации в геле является одним из наиболее эффективных методов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число индиви­дуальных антигенов в исследуемой жидкости и провести анализ их антигенного родства. В 1946 г. Дж. Оудин предложил метод простой диффузии, по которому один из компонентов реакции преципитации, обычно сыворотка, находится в ге­ле, а другой — антиген — наслаивается на первый в виде раствора. Антиген, диф­фундируя в гель, образует в нем с антителами белые линии преципитации, хоро­шо видимые при боковом освещении. В 1948 г. Ё. Оухтерлоню разработал еще бо­лее простой и удобный метод встречной двумерной диффузии, позволяющий про­водить прямое сравнение различных ан­тигенов и сывороток. Этот метод также является весьма ценным при исследова­нии перекрестных реакций (рис. 73).

Для постановки реакции по Оухтерло­ню используют 1 %-ный агар, приготов­ленный на физиологическом растворе, ко­торый разливают в чашки Петри слоем 0,5 см. После застывания в пластинке агара вырезают луночки диаметром 5—6 мм — одна в центре чашки, 4—5 — по окружно­сти на расстоянии 1—2 см от центральной. В центральную луночку наливают диагнос­тическую преципитирующую сыворотку, а в периферические — раствор гомологич­ного и сравниваемых с ним антигенов. Учет результатов проводят через 24, 48 и 72 ч инкубации при комнатной темпера­туре. Антитела и антигены диффундируют навстречу друг другу, и в участках, где со­здаются их эквивалентные концентрации,

образуются дугообразные полосы преципитации. Если полосы преципитации, иду­щие от двух соседних луночек, сливаются, это указывает на наличие нескольких ан­тигенных компонентов в исследуемой жидкости. Реакцию встречной диффузии по Оухтерлоню часто применяют для определения токсигенности бактерий, например дифтерийных (см. рис. 73).

Дальнейшим развитием метода преципитации в геле является иммуноэлектро- форез. Этим термином обозначают метод, объединяющий электрофоретическое разделение смеси антигенов и встречную диффузию по Оухтерлоню на одной и той же пластинке агарового геля. Преципитирующую сыворотку при этом наливают в канавку, вырезанную в геле параллельно направлению электрофоретического раз­деления. Образующиеся в результате реакции линии преципитации имеют вид дуг, вытянутых в направлении электрофоретического движения фракций антигенов. Иммуноэлектрофорез позволяет определять состав сложных смесей растворимых антигенов, содержащих до 30 компонентов, и является поэтому ценным диагности­ческим методом.