Метод стеклянных иммерсионных трубок честерса

Из прочного стекла изготовляют специальные стеклянные трубки, подобные пробиркам. Диаметр их может быть различным. Каждая трубка в нижней половине имеет несколько отверстий по 0,5 мм в диаметре. Имеется 3 типа трубок (рис. 7).

1. Трубка длиной 15 см и шириной 2 см с 9-ю отверстиями, расположенными по спирали в нижней части трубки. Отверстия делают так, чтобы их края были вровень со стенками трубки.

2. Трубка такого же размера, как и первая, с 6-ю наружными отверстиями, которые ведут к конусообразным внутренним капиллярам длиной 2 мм.

3. Трубка длиной 10 см и шириной 2,5 см. Конец трубки конусовидный и выдувается в виде луковицы. Он имеет 3 или 4 отверстия, расположенные на одном уровне.

Трубки стерилизуют и наполняют стерильной охлажденной до 50° питательной средой. Среда наливается до верхнего капилляра. Затем трубки вставляют в другие стерильные трубки большего диаметра (контейнеры) и в таком виде доставляют в поле (рис. 7, Д Е). Внутренние трубки вынимают и помещают в почву на нужную глубину и оставляют на 7—14 сут. Затем трубки вынимают и в новом контейнере доставляют в лабораторию. Содержимое трубок извлекают стерильной иглой, помещают его в стерильную чашку Петри в колонии, выросшие против капилляров, отсевают на свежую питательную среду. Метод рассчитан на то, что через капилляры в стенках трубки проникает только активно растущий мицелий.

Мюллер и Дюрель предложили более простую модификацию этого метода. Вместо стеклянных трубок, требующих специального выдувания, используют центрифужные пробирки из пластика. С помощью трафарета в них по спирали проделывают отверстия шириной 5 мм, расстояния между отверстиями могут варьировать. Пробирки обматывают изоляционной лентой и наполняют питательным агаром до высоты4 см, закрывают ватной пробкой и стерилизуют автоклавированием. Перед помещением в почву с помощью большой иглы, прокаленной на спиртовке, протыкают изоляционную ленту. Это делает возможным проникновение в пробирки активно растущего мицелия. После 4-6-суточной экспозиции в почве трубки вынимают и переносят в лабораторию. В лаборатории ленту разматывают и по мере разматывания каждого отверстия переносят участки агара, расположенного против отверстий, на чашки Петри со средой для культивирования грибов. Метод проще, чем предыдущий, и дает большую гарантию от загрязнения.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH)

Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH), представляет собой молекулярно-биологический метод, в котором олигонуклеотидный зонд, меченный флуоресцентным веществом, проникает в клетки бактерий. В случае если рибосомные нуклеиновые кислоты (рРНК) имеют подходящую последовательность по отношению к зонду, узнаваемую как мишень, то этот зонд будет присоединяться к своей мишени и не будет удаляться на последующем этапе промывания. Бактерии, в которых зафиксировался зонд, затем будут излучать флуоресцентный сигнал. Метод можно использовать для исследования структуры бактериальных сообществ.

На первом этапе происходит конструирование зондов. Обычно зонды содержат от 15 до 30 оснований по длине в виде участков одноцепочечных дезоксирибонуклеиновых кислот и направлены на специфический участок-мишень в микроорганизме.

Клетки фиксируют (водными растворами спиртов или альдегидов) на субстрате, как правило, на предметном стекле. В процедуре FISH затем применяется процедура гибридизации путем применения гибридизационного буфера, содержащего, один или несколько флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, содержащие олигонуклеотид с прикрепленным флуоресцентным маркером. Этот олигонуклеотид способен нацеливаться на специфическую последовательность в клетке бактерии (в 16S рРНК). Понятно, что присоединение означает образование водородных связей между комплементарными участками нуклеиновой кислоты. В FISH методике олигонуклеотидные зонды являются комплементарными и способны связываться с определенным участком рибосомной последовательности-мишени в микроорганизме. Затем проводят несколько стадий отмывок для удаления всех негибридизовавшихся зондов.

Визуализацию связавшихся ДНК-зондов проводят при помощи флуоресцентного микроскопа. Интенсивность флюоресцентного сигнала зависит от многих факторов — эффективности мечения зондом, типа зонда и типа флюоресцентного красителя.

В данном случае использовали 3 16S рРНК зонда: 1) EUB338 проба связывает высоко консервативные области в 16S рРНК бактерии и является специфической для домена (надцарства) бактерий. Также использовали зонды, специфические 2 клостридиальным кластерам: 2) Clost XIYa и 3) Clost XIYa -с. С 5’ конца пробы помечались флюоресцентными красителями Cy3, Cy5  или изотиоцианатом флуоресцеина  (FITC). Наложение 1) и 2) проб дали розовое свечение, 1) и 3) – бирюзовое. Белое свечение дала гибридизация с обеими группоцпецифическими пробами (менее 1% , выявленных клеток пробой 1).