Выделение и учет почвенных микроорганизмов на питательных средах

Для выделения и учета отдельных групп микроорганизмов приходится применять особые, часто специальные, приемы, методы и питательные среды. Они различаются в зависимости от биологических особенностей выделяемых микроорганизмов (автотрофы или гетеротрофы, аэробы и т.д.). Невозможно создать универсальную питательную среду, на которой бы развивались все почвенные микроорганизмы. При количественном учете микроорганизмов почвы желательно выделить по возможности более широкий круг микроорганизмов. Подбирают среды более универсальные — агаризированную воду, агаризованные почвы или почвенные вытяжки. На таких средах развивается большее количество микробов, чем на средах, богатых органическими веществами и элементами зольного питания. Однако какая среда не была бы применена, на ней удается учесть только незначительную часть (0,1 — 1%) микронаселения почвы. В литературе для обозначения микроорганизмов, выделяющихся на этих более универсальных средах (агаризованные почвенные вытяжки, среда Чапека для бактерий и актиномицетов, среда Эшби для олигонитрофильных микроорганизмов, МПА для бактерий), часто применяется термин «учет общей микрофлоры почвы». В действительности только прямые микроскопические методы дают истинное представление о количестве микробов в почве. Все методы выделения на питательные среды позволяют учесть только довольно ограниченную группу микроорганизмов.

В большинстве случаев для изучения и учета почвенных микроорганизмов проводится поверхностный посев 10-кратных разведений почвенной суспензии на чашки Петри с различными средами. При этом удается использовать один этот метод для изучения разных групп микроорганизмов — бактерий, актиномицетов, грибов и дрожжей.

Помимо учета общего количества микроорганизмов на питательных средах часто ставится задача изучения более узких групп микроорганизмов, называемых физиологическими группами. Это микроорганизмы, связанные с определенным этапом превращения органических или неорганических веществ. Например, определенные группы микроорганизмов, связанные с отдельными стадиями превращения азота: азотфиксаторы, нитрификаторы, аммонификаторы, денитрификаторы. Большое значение имеет изучение деллюлозоразлагающих микроорганизмов, микроорганизмов, способных использовать труднодоступные для растений соединения фосфора, а также участвующих в определенных этапах превращений серы, железа, марганца и т. д. Для учета определенных физиологических групп (фиксаторов азота, нитрификаторов, аэробного разрушение клетчатки) плотную селективную среду засевают комочками почвы по Виноградскому. Колонии образуются только вокруг тех комочков, которые содержат микробы изучаемой группы, и об активности процесса в почве судят по проценту таких комочков. Эта методика дает очень неточные результаты: разная величина комочков, не смотря разное количество микробов в комочке (при условии если «порог», необходимый для размножения микробов достигнут) считают, что выросла одна колония вокруг комочка.

Метод предельных разведений предполагает засев десятикратных разведений в пробирки с жидкими селективными средами. После инкубации в термостате устанавливают последнее разведение, в котором еще обнаружен рост (для точности используют 3-5 параллельных пробирок). В качестве теста используют также исчезновение субстрата или образование продукта (исчезновение тирозина и появления аммиака при изучении процесса аммонификации). Для расчета количества микробов используют таблицы Мак-Креди.

При работе в строго определенных и всегда одинаковых условиях применение разработанных методов позволяет получить правильное представление о биологическом состоянии почвы и сравнивать в этом отношении почвы между собой. Основные условия, которые для этого надо соблюдать:

1. Гомогенизация многочисленных проб почвы и проведения анализа возможно скорее после взятия проб. Наименьший вред приносит хранение почвы в холодильнике (медленное высыхание почвы).

2. Проводить все анализы при помощи методик, основывающихся на одном и том же принципе.

3. Учитывать скорость реакции (производить многочисленные анализы через определенные интервалы времени и выражать результаты в виде кривой).

4. Всегда работать в одинаковых и строго определенных условиях.

5. Ценность и даже значение микробиологического анализа почвы заключается в получении не абсолютных, а в основном сравнительных данных (различных горизонтов, ризосферы и контрольной почвы, почв, принадлежащих к одному и тому же или близким типам).

Методы изучений микробных ассоциаций и взаимоотношений между микроорганизмами и растениями непосредственно в почве

Методы прямого микроскопического подсчета не дают возможности составить представление о естественном распределении микробов, об ассоциациях почвенных микроорганизмов в естественных условиях. При использовании этих методов почвенные микробы оказываются перемешанными в процессе приготовления почвенной суспензии. Существуют специальные методы, которые позволяют судить о естественном распределении микроорганизмов в почве.

МЕТОД СТЕКОЛ ОБРАСТАНИЯ ХОЛОДНОГО

Метод Холодного и его модификации широко применяются в почвенной микробиологии. С их помощью были получены интересные материалы о почвенных микробных ассоциациях, открыты новые формы микроорганизмов, изучены микроорганизмы разных почв и т. д.

В почву вносятся предметные стекла, поверхность которых вскоре покрывается почвенными коллоидами, где микроорганизмы развиваются в условиях, близких к естественным. Поверхность стекла, конечно, не может полностью имитировать поверхность почвенных частиц, на которых в действительности развиваются почвенные микроорганизмы. В связи с этим делались неоднократные попытки заменить стекло другими материалами (нейлоновая ткань, полиэтилен), но пока это не получило большого распространения.

Перед закладкой в почву предметные стекла тщательно очищают, выдерживая их в концентрированной серной кислоте, и отмывают в 1%-ном растворе соды и в дистиллированной воде.

На поверхности почвы делают разрез ножом и в него вертикально вставляют предметное стекло. Необходимо по возможности сохранить естественное сложение почвы и, зарывая стекло, стремиться создать такую же плотность почвы, какая была до постановки опыта. Стекла закапывают так, чтобы их верхний край был не ближе чем на 1—3 см от поверхности почвы. Всегда ставят несколько параллельных стекол. Места нахождения стекол тщательно отмечают. В почве стекла экспонируют месяц и более.

По истечении срока экспозиции стекла извлекают так, чтобы не повредить микробные ассоциации на той стороне стекла, которая будет подвергаться микроскопированию. Нельзя допускать скользящего движения стекла по почве, так как при этом развившиеся на стекле микроорганизмы могут счищаться. Нижнюю сторону стекла тщательно протирают, а верхнюю подсушивают на воздухе, фиксируя на пламени горелки или в парах осмия, и помещают в стакан с водой, чтобы отделить от стекла крупные почвенные частицы, которые мешали бы дальнейшему исследованию. После промывки препарат красят карболовым эритрозином и просматривают под микроскопом.

Из вариантов метода Холодного наибольшее распространение получила модификация А. В. Рыбалкиной и Е. В. Кононенко (1957). В этом случае перед закладыванием стекол в почву на их поверхность наносят слой крахмало-аммиачного агара. Микроорганизмы развиваются быстрее и лучше, но внесенное на стекло органическое вещество создает специфические условия для развития микроорганизмов.

Хорошие результаты получаются при изучении стекол обрастания при помощи люминесцентной микроскопии. Стекла окрашиваются водным раствором акридина оранжевого (1 : 10 000) . Клетки микробов в этом случае по сравнению с окрашиванием эритрозином видны более четко, кроме того, видны клетки, расположенные на поверхности почвенных частиц, прилипших к стеклу.