14

Тема 2. Методы исследований, используемые в почвенной микробиологии

Почвенную микробиологию следовало бы рассматривать как самостоятельную дисциплину, т.к. она подходит к изучению почвенных явлений с совершенно особых позиций с использованием собственных методов. Основной особенностью микробиологического анализа почвы является его экологическая направленность: он должен обеспечить сохранение существующих между микроорганизмами взаимоотношений, как синергических, так и антагонистических. Значительно сложнее изучать поведение различных групп микроорганизмов, находящихся в динамическом взаимодействии друг с другом, чем поведение определенных видов в чистых культурах. Эта экологическая направленность почвенной микробиологии заставляет применять очень специальные методы; методы обычной микробиологии, основанные на изучении свойств чистых культур в данном случае непригодны.

Общую активность почвы можно оценивать по выделению углекислоты. Важно при использовании этого метода соблюдать строго определенные условия на протяжении всего опыта (постоянная температура, влажность, аэрация), что затрудняет проведения как в поле, так и в лаборатории. Выделение углекислоты можно оценивать, используя газометрическую методику Варбурга. Необходимо подчеркнуть, что даже в оптимальных условиях количественное определение выделившейся углекислоты дает представление лишь относительно общего результата этого процесса и не позволяет получить никаких сведений о его механизме.

Количественное определение общей микрофлоры

Прямые микроскопические методы

Прямые микроскопические методы дают возможность определять общее количество отдельных групп микроорганизмов. Однако даже и при применении прямых микроскопических методов можно подсчитать только количество бактерий. Особые микроскопические методы необходимо применять для подсчета грибов и совершенно специфические — для подсчета почвенных водорослей и беспозвоночных животных. Таким образом, когда определяется общее количество микроорганизмов в почве (точнее было бы говорить об определении общего количества бактерий), то из полученных данных можно определить только- биомассу бактерий, а не общую биомассу почвенных микроорганизмов.

Следует учитывать, что общее количество микроорганизмов (и их биомасса) характеризует только потенциальный запас микроорганизмов в почве, но эти цифры еще не говорят о том, какая часть микроорганизмов находится в активном, а какая часть в покоящемся состоянии.

Для получения более полной информации нельзя ограничиваться определением количества микроорганизмов и их биомассы на 1 г почвы, но необходимо проводить пересчет количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы с учетом количества микроорганизмов по всему почвенному профилю, расчета содержания микроорганизмов в столбике почвы с площадью поверхности в 1 см² (определения количества микроорганизмов на единицу поверхности почвы).

Общее содержание микроорганизмов — величина консервативная и малоподвижная, поэтому определение его мало пригодно для установления влияния различных факторов на микрофлору почв (например, влияния пестицидов, удобрений и т. д.).

Прямые методы определяют в 1000 раз больше бактерий, чем посев на питательные, даже малоэлективные среды.

Часто для прямого микроскопического изучения почвы применяют метод С. Н. Виноградского, причем обычно пользуются модификацией этого метода, предложенной О. Г. Шульгиной. Тщательно отобранную среднюю пробу почвы массой в 5 г помещают в 250-миллилитровую колбу, содержащую 45 мл воды. Вода не должна содержать клеток микроорганизмов. По оригинальной прописи колбу энергично встряхивают 5 мин. Рекомендуется для более полного учета числа бактерий обрабатывать почвенную суспензию ультразвуком или при отсутствии ультразвуковой устновки на микроизмельчителе тканей. В течение нескольких секунд дают осесть наиболее крупным почвенным частицам и затем пипеткой, с точно вымеренной величиной капли, наносят одну каплю на поверхность чистого обезжиренного предметного стекла. Одновременно с каплей суспензии на стекло наносят каплю 0,1%-ного очищенного от микробных клеток агара. На стекле, на которое наносят суспензию, предварительно отмечают прямоугольник площадью в 8 см², ширина которого равна ширине стекла. Нанесенную взвесь при помощи покровного стекла помешивают и равномерно распределяют по поверхности всего прямоугольника. Препарат подсушивают и фиксируют над пламенем горелки или 96 % спиртом, окрашивают карболовым эритрозином (окрашивание длительное от 1 ч до суток). Краску смывают, последовательно погружая стекла в 4—5 стаканов с водой. Препараты высушивают и помещают под микроскоп (масляная иммерсия, 90Х).

Расчет количества клеток в 1 г воздушно-сухой или абсолютно сухой почвы проводят по формуле

А • 8 • 10⁹ • (Р+ 100)

Б • В • Г

где А — общее количество учтенных на стекле клеток; Б — площадь поля зрения (мкм²), определяется при помощи объект- микрометра; В — объем нанесенной суспензии (мл); Г — количество просчитанных полей зрения; Р — влажность почвы (%).

После проведения количественного учета микроорганизмов следует вычислить величину биомассы микроорганизмов в почве. Для этого нужно знать среднюю величину клетки микроорганизмов, которую можно получать после измерения под микроскопом размеров клеток, встречающихся в данной почве. Затем количество клеток в 1 г почвы умножается на средний объем клетки и на их удельный вес (1,10 г/см³). Часто делают пересчет биомассы микроорганизмов в т/га. Вычисляют вес живых клеток и вес сухих клеток.

Одним из наиболее совершенных методов выявления, изучения и количественного учета микроорганизмов в их естественной среде обитания является люминесцентная микроскопия в падающем свете. Метод сводится к тому, что приготовленные из почвенной суспензии препараты окрашиваются специальным красителем (флуорохромом) акридином оранжевым (1:10000, 2-4 мин). При использовании данного метода достигается более уверенный подсчет бактерий в почве по сравнению с методом Виноградского. Яркие зеленые клетки хорошо заметны на темном или красном фоне почвенных частиц и препарата, причем микроскопия в отраженном свете позволяет учитывать и адсорбированные клетки, которые, как правило, не видны в проходящем свете (метод Виноградского).

Предложено несколько вариантов методов люминесцентной микроскопии для количественного учета почвенных микроорганизмов: от окрашивания почвенной суспензии с подсчетом микроорганизмов в специальных камерах или в капиллярах Перфильева до окрашивания фиксированных препаратов. Окрашивание готовых препаратов является наилучшей модификацией метода (метод Звягинцева и Кожевина). В этом случае отпадает необходимость в предварительном подборе оптимальной концентрации флуорохрома для каждой почвы, и не требуется специальной камеры для количественного подсчета. К тому же препараты до окрашивания и подсчета могут достаточно долго храниться, что позволяет проводить подсчет не по ходу опыта, а в удобное для исследователя время. Препарат из почвенной суспензии готовят аналогично предыдущему методу, но на площади 4 см², наносят 0,01 мл.

Количество микробных клеток, содержащихся в 1 г почвы, вычисляют по формуле

М = 4•а•н • 10¹⁰,

р

где М — количество клеток в 1 г почвы, а — среднее число клеток в поле зрения, р — площадь поля зрения (мкм²), н — показатель разведения.

Для подсчета рекомендуется из каждого почвенного образца готовить два препарата и на каждом препарате подсчитывать клетки в пяти полях зрения.

Современные электронные микроскопы с разрешением'2—5 А позволяют отличить мельчайшие микроорганизмы в почвенной суспензии и определить их численность (Никитин, Макарьева, 1970). Работы Д. И. Никитина показали, что в почвах содержится множество новых форм микроорганизмов, которые не определяются с помощью других методов. При применении методов предварительного диспергирования почвы и десорбций микроорганизмов с помощью электронной микроскопии удается подсчитать наибольшее ко сравнению с другими методами количество микробов.

Диспергированную почвенную суспензию помещают в стерильный мешочек из синтетического полупроницаемого материала и подвергают диализу в стерильной дистиллированной воде в течение 3—12 ч. После диализа взвесь в количестве 3-8 мкл наносят стерильной микропипеткой на пленки-подложки для электронного микроскопа. После высыхания капель препараты оттеняют металлом (хромом или окисью вольфрама) и просматривают в электронном микроскопе. Для получения достоверных данных необходима вариационно-статистическая обработка материала, позволяющая установить ошибку средней арифметической, разброс рассчитанных величин, точность и надежность опыта.