Функции неструктурных белков.

NS 1. Состоит из двух доменов: N-концевой обладает метил-трансферазной активностью, а С-концевой – гуанилтрансферазной. Это кэпирующий фермент. Отличается последовательность реакций синтеза кэпа: если в клетке сначала происходит присоединение гуанила, а потом его метилирование, то вирусный фермент сначала метилирует гуанин, а потом присоединяет его к 5’-концевому нуклеотиду. Подобный кэпирующий фермент есть у Poxviridae, аналогично ему NS1 (уточнить!!!) может выполнять и другие функции, например, участвовать в регуляции репликации.

NS2 (P2). Обладает тремя активностями: хеликазной, протеазной и γ-фосфатазной. Участвует в кэпировании РНК, процессинге полипротеина.

NS3 (P3). Возможно, он регулирует активность NS2, предполагается, что он может служить мембранным якорем, потому что имеет высокогидрофобные учаскти. И все же его функции не известны.

NS4 (P4). РНК-зависимая РНК-полимераза.

Временная регуляция синтеза РНК α-вирусов.

В клетках пораженных α-вирусами на первой стадии происходит преимущественный синтез (-) цепей. На второй стадии прекращается синтез (-) цепей РНК и происходит накопление (+) цепей геномной РНК. На третьей стадии синтезируются (+) цепи геномной РНК и субгеномная РНК.

У некоторых α-вирусов между генами NS3 и NS4 находится терминирующий кодон. Он преодолевается полимеразой за счет его супрессии.

Связь протеолиза с временной регуляцией синтеза рнк.

На примере α-вирусов хороша заметна роль протеолиза в регуляции репликации вируса. От степени процессированности полипротеина неструктурных белков зависит какой РНК продукт будет преобладать в инфицированной клетке.

123 4 преимущественно синтезируются (-) РНК.

1 23 4 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и какая-то часть (-) РНК

1 2 3 4 преимущественно синтезируются (+) геномные РНК и субгеномная РНК.

Разрезание полипротеина осуществляет белок NS2. Отщепление белка NS4 происходит при in trans протеолизе, когда взаимодействуют две молекулы полипротеина.

Вырезание белка NS1 происходит in cis и, причем медленно. NS2 и NS3 разделяются быстро в in trans протеолизной реакции.

Процессинг полипротеина смоделирован in vitro. Показано также, что процессинг осуществляется в репликативных комплексах и ассоциирован с мембраной. Из клеток можно выделить пузырьки, содержащие полипротеин на разной стадии процессинга, в которых репликация находится на разных стадиях.

Синтез (-) цепи.

Видимо, синтез (-) РНК происходит на циркуляризованной (+) РНК. Образование кольца возможно благодаря взаимодействию PABP, связанного с 3’полиА, с eIF4G – фактора инициации трансляции, связанного с кэпом.

В 3’ области имеется также консервативная последовательность длиной 19 нт, ее достаточно для инициации синтеза (-) РНК при наличии полиА-хвоста. Можно удалить полиА-хвост, но он все равно восстановится с помощью клеточной полиА-полимеразы по механизму реитерации полимеризации. Можно удалить консервативный элемент и вирус все равно выживает, тогда на его 3’-конце обнаруживаются AU-богатые последовательности.

Известно также, что в клетках гиперинфицированных вирусом появляются дефектные геномы, имеющие делеции протяженных участков генома. Такие дефектные вирусы могут реплицироваться в присутствии вируса-помощника. Следовательно, они имеют все необходимые для репликации регуляторные элементы. У этих РНК была определена структура. Выяснилось, что 5’-конец этих РНК содержит шпилечную структуру (150-200 нт). Далее находятся две несовершенные шпильки, функция которых не ясна.

Синтез субгеномной РНК.

Если (-)цепь всегда находится в дуплексе с (+) цепью РНК, то как инициировать синтез субгеномной РНК? Существует гипотеза о том, что синтез происходит с высвобождением цепи, но у этой гипотезы нет экспериментального подтверждения.

Фактом является наличие промотора для синтеза субгеномной РНК, фланкированный структурами. С использованием этого промотора сконструированы векторы для генной терапии.

В конструкте структурные гены, находящиеся под этим промотором, замещаются на ген нужного белка, например CAT. Можно одновременно вводить в клетку субгеномную РНК, кодирующую капсидные белки, при этом лишив вируса цитотоксичности. В такой системе между обоими РНК будет конкуренция за упаковку в капсид.

Одной из проблем использования РНК-векторов α-вирусов является рекомбинация.

В настоящее время, вирусы объединяют в группу claster C вирусов. Они характеризуются только отличиями в капсидных белках. Отличия обясняются тем, что в природе вирусные геномы рекомбинируют. Поэтому по частичному сиквенсу генома вируса сложно определить таксономическое положение вируса. В эту группу входят EEEV (α вирус), Simbis и WEEV, рекомбинант геномов EEEV и Simbis, от первого получены гены неструктурных белков, а от второго – гены структурных белков.

α вирусы растений.

Геном представлен одноцепочечной (+)РНК. РНК имеет 5’-конце кэп, на 3’-конце может находиться полиА, гетерополимер или тРНК-подобная структура.

Cap PolyA

Cap Heteropolymer

Cap tRNA-like structur

В геноме закодированы белки NS1 и NS2, а также аналог NS4.

тРНК подобная структура узнается CTP/ATP-тРНК нуклеотидил трансферазой, которая добавляет А к СС:

СС ССА

Матрица, имеющая на 3’-конце А, более эффективно используется в репликации. Синтез (-) цепи начинается с G.

тРНК подобная структура РНК узнается определенной аминоацил-тРНК синтетазой. Например, РНК вируса табачной мозаики (TMW) узнает гистидиновая аа-тРНК-синтетаза, РНК вируса мозаики костра – тирозиновая, а РНК вируса желтой мозаики турнепса – валиновая аа-тРНК-синтетаза. Часто первой N-концевой аминокислотой становится соответствующая аминокислота. Зачем это нужно? Может так сложилось эволюционно? Нарушение способности РНК вируса акцептировать аминокислоту приводит к подавлению ее трансляции. тРНК-подобная структура, возможно участвует в переключении между репликацией и трансляцией РНК.

Синтез (-) цепи.

На примере вируса мозаики костра. Это трехкомпонентный вирус, т.е. при транскрипции образуется три мРНК. Третья РНК имеет субгеномный промотор.

Синтез (-) цепи инициируется в две стадии. На 3’-конце имеется шпилька, которая связывает РНК-полимеразу. Положение этой шпильки можно изменять, тогда инициация синтеза будет происходит в том месте, где находится шпилька. Синтез РНК начинается на участках СССА и может начаться также на внутренних ССС. Инициация происходит предпочтительно на тех участках, которые находятся вблизи шпильки.

Роль клеточных белков в репликации вирусной РНК.

Могут принимать участие система декэпирования, а также десатураза жирных кислот.

Рекомбинация РНК.

Внутри промоторов для полимеразы локализуются горячие точки рекомбинации.

РНК-интерференция в клетках, пораженных ВТМ.

30 лет назад было обнаружено, что в клетках, инфицированных ВТМ увеличивается количество активной РНК-зависимой-РНК-полимеразы. Тогда предположили, что индуцируется синтез клеточного фермента, но не могли понять почему в клетках специфически синтезируются короткие фрагменты РНК. Явлению не нашли разумного объяснения и забыли, а это была система РНК-интерференции.