Лекция 11

Сегодня мы рассмотрим две группы РНК-содержащих вирусов: пикорнавирусы и альфавирусы.

Пикорнавирусы.

Мелкие вирусы Ø 20 нм, без оболочки, капсид икосаэдрический. Геном представлен одноцепочечной (+) РНК длиной 7,5 – 8.0 т.п.н.

Пикорнавирусы известны как модельные системы, на которых сделано много открытий. Например, впервые сформулировано положение о моноцистронности эукариотических РНК; открыта внутренняя инициация трансляции; обнаружен РНК-зависимый синтез РНК и фермент его катализирующий; обнаружена двуспиральная РНК; показано участие нуклеотид-белковой затравки в синтезе нуклеиновых кислот; обнаружена РНК рекомбинация; сделано первое картирование генома, причем по продуктам трансляции.

In vitro был осуществлен синтез полиовируса. Искусственно синтезированные фрагменты ДНК лигировали и на этой матрице синтезировали РНК. Правда, для этого потребовалось очень много времени. Недавно таким же образом была синтезирована ДНК фага φХ174, но для этого понадобилось всего две недели.

Представители: полиовирус, вирус гепатита А, вирус ящура, риновирусы (возбудители ОРЗ и ОРВ), вирус энцефаломиокардита.

Структура генома.

VPg PolyA

К 5’-концу ковалентно (через тирозин – урацил) пришит белок, а на 3’-конце имеется полиА последовательность, синтезируемая матричным способом.

В 5’-НТО размером 600-1000 нт. находится IRES, а также последовательность polyС, функции которой не ясны, но известно, что ее удаление вызывает изменение фенотипа. Продуктом трансляции является единый полибелок, который далее нарезается на отдельные белки.

В 5’ и 3’-НТО находятся также цис-регуляторные элементы репликации (они не консервативны) oriL и oriR соответственно. У энтеровирусов и риновирусов в 5’-НТО находятся консервативные элементы, организованные в структуру типа клеверного листа.

Капсид 2 3

5’НТО 1 2 3 4 2А 2В 2С 3А 3В 3С 3D 3’НТО polyA

oriL ori I oriR

Имеются также внутренние репликативные элементы – CRE (Cis-acting replicating element) иначе ori I.

Геном можно условно разделить на три части. В первой части закодированы структурные белки капсида, в третьей части, в гене 3D, закодирована РНК-зависимая РНК-полимераза.

Механизм репликации.

Схемы репликации постоянно меняются и ниже излагаемая видимо не последняя. Причина заключается в методологической сложности создания системы, позволяющей изучать процесс in vitro. В случае фага Qβ создание системы in vitro возможно, а, например, у полиовирусов репликация идет только в грубо очищенных экстрактах (фракция 10000g), выяснилось, что процесс связан с мембранами. В пораженной клетке развивается система мембранных пузырьков вытянутой формы, называемых репликативными комплексами. Можно показать, что в таких пузырьках сосредоточены все неструктурные белки и идет репликация. В трансформации мембранной системы задействованы белки 2В, 2С и полибелок 2ВС. Соответственно реагенты, ингибирующие образование мембранных пузырьков, подавляют и репликацию вируса.

Инициация синтеза (-) цепи РНК.

Необходимо наличие мембран, происходит на циркуляризованной нековалентными взаимодействиями (+) цепи. Циркуляризация (+) РНК осуществляется посредством образования рибонуклеопротеидных комплексов. В 5’ и 3’-НТО находятся элементы узнаваемые белками, в 5’-НТО – с PolyC связывается PCBP (PolyC-Binding Protein) с 3’-НТО связывается PABP (PolyA-Binding Protein). После связывания с элементами РНК эти белки приобретают сродство друг к другу, и посредством такого белкового мостика, РНК циркуляризуется. Клеточный фактор инициации трансляции – eIF4G (входит в состав фактора eIF4F), связывается с IRES в 5’-области и также имеет сродство к РАВР.

Вирусные белки 3CD и 3AB взаимодействуют с одной из шпилек в 5’-концевой структуры. 3СD может также связываться с мембраной, закрепляя всю структуру.

3АВ

3СD

Образование кольцевой молекулы РНК можно рассматривать как контроль качества, потому что только целая молекула может свернуться в кольцо.

В одной из работ был показано, что синтез (-) цепи можно осуществить in vitro и в отсутствии мембран с помощью очищенной полимеразы на искусственной матрице полиА, при этом также как и in vivo происходит ковалентное присоединение VPg. Однако, следует учитывать чувствительность метода, в малых количествах (-) цепь образуется и в отсутствии мембран, но выход реакции очень мал по сравнению с системами in vivo.

Структура ori R.

Этот участок длиной 70–100 нуклеотидов образует две шпилечные структуры, способные взаимодействовать друг с другом путем kissing взаимодействий. Изменение конформации этого участка влечет блокирование инициации репликации, но его полное удаление не влияет на инициацию синтеза (-) цепи. Участок получил даже название элемент Ильфа (так звали вахтера, который тщательно проверял пропуска, но когда пропуска не было, то пропускал так).

3АВ

3CD

Возможно, как у фага Qβ за счет этой структуры происходит запрятывание некоторого элемента, с которым взаимодействует полимераза – поли-А-хвост. Этот элемент открывается в рибонуклеопротеидном комплексе. С этой структурой взаимодействуют вирусные белки 3AB и 3CD. В комплексе белок С вырезает VPg (белок 3В) и полимеразу (белок 3D). Полимераза тут же начинает синтез РНК.

Далее по этой модели при синтезе (-) цепи РНК происходит образование дуплекса РНК, вследствие этого вытесняется 5’-концевой белковый комплекс. Далее он взаимодействует с внутренним ori I. Этот участок имеет конформацию петли и может находится у разных вирусов в разных частях генома, например, у пикорнавирусов в гене 2С, у ринавирусов в гене VP1, у вируса ящура в 5’НТО. Положение петли не имеет решающего значения для репликации.

С

А

А

А

На этой шпильке происходит синтез множества копий диуридилата, ковалентно-связанного VPg. Механизм такой же как у аденовирусов, φХ174 – шаг вперед, два шага назад. Считается, что эти структуры служат затравками для синтеза (-) цепей РНК. Синтез идет до тех пор пока полимераза не дойдет до этого участка. За это время синтезируется около 100 штук VPg-pUpU, это значит, что должно быть около 100 белков VPg, значит нужно около 100 раз протранслировать (+) цепь.

В итоге образовалась репликативная форма – двуцепочечная ±РНК.

Двуцепочечная форма РНК была впервые обнаружена у вируса энцефаломиокардита. Эта форма инфекционна, тогда как у Qβ – нет. Что дальше: возможна транскрипция ± РНК – (+) РНК или расплетание (у млекопитающих есть клеточные РНК-хеликазы). Факт тот, что свободных (-)цепей в клетке не обнаруживается.

Механизм инициации синтеза (+) цепей.

Может быть для синтеза достаточно VPg-pUpU.

Чтобы на (-) цепи осуществить синтез (+) цепи нужно вытеснить предыдущую цепь. Для этого требуется хеликазная активность. У белка 2С пикорнавирусов имеется участок подобный РНК-зависимой АТФазе и показано, что он участвует в синтезе РНК (в миллимолярных концентрациях). Однако, напрямую не показано, что 2С нужен как хеликаза. У полиовируса РНК-полимераза может сама вытеснять цепь, но хеликаза ей может помочь.

Для синтеза (-) цепи (??????) нужна трансляция. При трансляции происходят структурные изменения (какой цепи?), приводящие к обнажению 3’-конца (какой цепи?).

Транскрипция и трансляция не могут одновременно происходить на одной цепи, они должны быть разнесены во времени.

Переключателем между этими процессами может служить клеверная структура 5’-НТО. Другим переключателем может быть PCBP, который может связываться и с IRES, блокируя инициацию трансляции, следовательно, чем больше РСВР, тем слабее трансляция.

Для образования вирусных частиц нужно 60 молекул структурного белка. Поскольку при трансляции образуется полипротеин, то, в таком случае, образуется столько же копий и неструктурных белков, но их нужно мало. В случае РНК-полимеразы известно, что транскрипцию осуществляет только свежий «фермент».