Векторы замещения на
основе фага λ
Геном фага λ
|
Гены |
Cos L Левое плечо |
лизогенного |
пути |
Правое |
Cos R |
плечо |
|
Гены, белковые продукты которых необходимы для формирования капсидов и упаковки в них фаговой ДНК
Гены отвечающие за репликацию фаговой ДНК и лизис клеток
Вектор замещения
полилинкер
Фрагмент
чужеродной
ДНК 15-24 тпн
Эффективно упаковываются в фаговую частицу ДНК размером 38-51 тпн. Ограничение по размеру вставки не позволяет клонировать целиком, например, некоторые гены животных, имеющих большие размеры в силу их экзон-интронной организации. Например, ген
дигидрофтолатредуктазы мыши – 32 тпн, ген коллагена
Векторы замещения на основе фага λ
Негативные колонии бактериофагов T4, T3 и T7 (фаговые бляшки)
Космиды
КОСМИДА = COS-САЙТ + ПЛАЗМИДА
Космиды – это плазмидные векторы, в которые встроен участок генома фага λ (Cos-сайт), обеспечивающий упаковку этой ДНК в фаговую частицу.
AbR
Cos
рестрикция
|
MC S |
+ |
Ori |
|
лигрование
Фрагмент ДНК 40 тпн
45 тпн
упаковка in vitro
Космиды |
тупые концы |
|
|
|
|
Фазмиды |
|
ФАЗМИДА = ФАГ + ПЛАЗМИДА |
||
Фазмиды (фагмиды) – это векторы, являющиеся |
|||
гибридом между фагом и плазмидой и способные |
|||
после встраивания чужеродной ДНК существовать и |
|||
как фаг, и как плазмида. |
|||
|
|
|
Размер pMYF131 таков, что она |
Ori |
AbR |
|
не может эффективно |
|
|
|
упаковываться в фаговые |
плазмида |
|
частицы. Упаковка становится |
|
|
возможной после встройки |
||
pMYF131 |
чужеродной ДНК. Размер |
||
Для поддержания фазмиды в |
|||
|
33 тпн |
клонируемого фрагмента |
|
|
клетках в виде плазмиды |
||
|
|
|
около 15 тпн. |
|
Cos |
Ori |
используют штаммы E. coli |
|
лизогенные по фагу λ. Такие |
||
|
|
|
|
Часть генома фага λ, |
штаммы продуцируют фаговый |
||
белок-репрессор cI, подавляющий |
|||
содержащая гены |
развитие фага по литическому |
||
литического пути |
|||
Фазмида на |
пути. Для перевода фазмиды в |
||
основе фага λ и |
фаговую форму меняют условия |
||
плазмиды pUC19 |
культивирования (например, |
||
Искусственные бактериальные хромосомы
Бактериальные искусственные хромосомы (ВАС, bacterial artificial chromosome) разработаны на основе F-плазмиды E. coli. Эти векторы имеют низкую копийность (1-2 копии на клетку), благодаря чему обеспечивается высокая стабильность клонированных фрагментов ДНК. Размер клонируемых фрагментов обычно 125-350 тпн.
CmR
oriS
|
pBAC108L |
parB |
6,9 тпн |
|
|
parA |
|
|
repE |
oriS – ориджин репликации F-плазмиды
repE – ген, продукт которого обеспечивает репликацию плазмиды с
oriS
parA и parB – гены, продукты которых обеспечивают правильно расхождение плазмид по дочерним клеткам во время
BAC вводят электропораци ей, используя оптимизирован ную процедуру и специальные штаммы E. coli
АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПОДХОДЫ
Химико-ферментативный
CCTTACGAGTTAATTAATTсинтез генов TCATTTTATAAATCTAATT
AAAGGGATGGGAGCTAAGA
CCAATGTGTACGCAGCGCC
TCAACATGGATTCAGCCTC
AAGCTTTCGGACAAAAAGG
GTATAAATACCAACAAGTG
AACGGCACTACCACTTCCA
CAACGCTGTCATTGGCGCA
CGACATCCAAAAAGGCAAA
ACACTGTCTACTCTGGAAG
TCTTGCACAAAATCGATAA
Последовательность Химический синтезФерментативнаяКлонирование нуклеотидов олигонуклеотидов «сборка»
Направленная ПЦР участка генома
Вопросы для |
|
самоподготовки |
|
• |
Принципы создания библиотек |
|
генов (геномных библиотек). |
• |
Селективные маркеры в |
|
генетических векторах: прямой и |
|
непрямой отбор. |
• |
Скрининг библиотек генов. |
• |
Библиотеки кДНК. |
• |
Представительность библиотек |
|
генов и емкость генетических |
|
векторов. |
• |
Генетические векторы на основе |
|
фага лямбда: векторы замещения, |