МОЛЕКУЛЯРНОЕ КЛОНИРОВАНИЕ
ГЕНЕТИЧЕС
КИЕБИБЛИ
ОТЕКИ
СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ, НЕСУЩИХ
РЕКОМБИНАНТНЫЙ ВЕКТОР
ApR |
TcR |
pBR32
2
Ori
Ap – ампициллин Tc – тетрациклин
Ap |
Ap + |
|
Tc |
СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ, НЕСУЩИХ
РЕКОМБИНАНТНЫЙВекторы прямогоВЕКТОР
отбора
ApR |
LacZ |
Для того, чтобы отбор |
|
|
|
|
pUC19 |
работал, нужен |
|
специальный штамм |
|
|
|
|
|
|
E. coli lacZ M15 |
Ori
α-Комплементация. Активная β-галактозидаза – это тетрамер. Делеция lacZ M15 удаляет аминокислотные остатки 11–41. Белок с такой делецией (ω-фрагмент) может димеризоваться, но не может тетрамеризоваться. Амино-концевой фрагмент β-галоктазидазы, соответствующий остаткам 3–92 (α-fragments) восстанавливает ферментативную активность LacZΔM15, переводя белок в тетрамерную форму.
СЕЛЕКЦИЯ КЛОНОВ, НЕСУЩИХ
РЕКОМБИНАНТНЫЙОтбор синее/белоеВЕКТОР
ApR |
LacZ |
pUC19
Ori
Ap + X-
Gal
X-gal
5-бромо-4-хлоро-3-индоил- |
5-бромо-4-хлоро- |
5,5'-дибромо-4,4'-дихлоро-индиго, |
бета-D-галактопиранозид |
3-гидроксииндол |
нерастворимый окрашенный продукт. |
Как найти нужный клон ?
ПОДХОДЫ К АНАЛИЗУ БИБЛИОТЕК
Скрининг с помощью гибридизации
Иммунологический скрининг
Скрининг по активности белка
Скрининг с помощью
гибридизации
Выбор зонда
Известна последовательность целевого гена
Известна последовательность родственного гена
(генов)- Если ожидается, что гомология высокая, то в качестве зонда
может быть выбран олиго- или полинуклеотид с последовательностью родственного гена.
- На основании сравнения группы родственных генов в
качестве зонда может быть выбран участок с
Известна последовательность целевого белка
высококонсервативной последовательностью. - Если известна последовательность или часть
последовательности целевого белка, то на ее основе может быть сконструирован вырожденный зонд.
- На основании сравнения группы родственных белков может быть выбран участок с высококонсервативной
последовательностью и на его основе сконструирован вырожденный зонд.Вырожденный зонд
Аминокислотная |
Нуклеотидная |
|
Количест |
|
последовательно |
последовательнос |
во |
|
|
сть |
ть |
|
варианто |
|
Met-Gln-Lys-Phe-Asn ATG-CAA/G-AAA/G-TTT/C-AAT/C |
в |
16 |
||
Met-Ser-Leu-Gly |
ATG-ТСТ/C/A/G-СТТ/C/A/G-GGТ/C/A/G |
|
144 |
|
|
AGТ/C |
TТA/G |
|
|
|
|
|
|
|
