Иммуноферментный анализ (ифа)

В качестве метки используются ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза и др.

Индикатором реакции является способность ферментов вызывать цветные реакции при действии на соответствующий субстрат. Например, субстратом для пероксидазы является раствор ортофенилдиамина.

Наиболее широко применяется твердофазный ИФА (см. прилож.3, рис.11 и 12).

Сущность ИФА аналогична РИА.

Результаты ИФА можно оценить визуально и измерением оптической плотности на спектрофотометре.

К преимуществам ИФА следует отнести:

- отсутствие контакта с радиоактивными веществами;

- простота методов оценки реакции;

- стабильность конъюгатов;

- легко поддаётся автоматизации.

Однако по сравнению с РИА отмечают более низкую чувствительность метода, но в некоторых случаях чувствительность превосходит РИФ и РИМ.

В качестве примеров приводятся следующие типы ИФА:

Конкурентный тип.

Предназначен для выявления поверхностного антигена вируса гепатита В (HBs Ag) в сыворотках и плазме крови при диагностики вирусного гепатита В и определение носительства HBs Ag.

Компоненты:

1. исследуемый материал – сыворотка или плазма крови;

2. антитела к HBs Ag, адсорбированные на поверхности лунки полистиролого микропланшета;

3. конъюгат – мышиные моноклониальные антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой

4. ортофенилендиамин (ОФД) – субстрат

5. фосфатно – солевой буфер

6. контрольные сыворотки:

- положительная (сыворотка с HBs Ag)

- отрицательная (сыворотка без HBs Ag).

Ход работы.

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток.

2. Инкубация 1 час при 37⁰ С

3. Отмывание лунок.

4. Внесение конъюгата

5. Инкубация 1 час при 37⁰ С

6. Отмывание лунок.

7. Внесение ОФД. При наличии HBs Ag раствор в лунках желтеет.

Учёт ИФА проводят по оптической плотности с помощью фотометра. Степень оптической плотности будет обратно пропорциональной концентрации исследуемых HBs Ag.

Механизм.

Реакция протекает в три фазы:

1. HBs Ag исследуемой сыворотки (плазмы) связывается с гомологичными АТ, адсорбированными на поверхности лунки. Образуется ИК АГ - АТ. (HBs Ag – anti HBs АТ).

2. Антитела к HBs Ag, меченые пероксидазой связываются с оставшимися свободными детерминантоми HBs Ag комплекса АГ-АТ. Образуется комплекс АТ-АГ-меченые АТ (anti HBs АТ-HBs Ag-anti HBs АТ, меченые пероксидазой).

3. ОФД взаимодействуют с пероксидазой комплекса АТ-АГ-АТ и происходит жёлтое окрашивание.

Непрямой тип.

Является основной тестовой реакцией диагностики ВИЧ – инфекции.

Цель: Серологическая диагностика ВИЧ-инфекции – обнаружение антител к антигенам ВИЧ.

Компоненты:

1. исследуемый материал – сыворотка крови (АТ к АГ-м ВИЧ)

2. синтетические пептиды имитирующие 2-х антигенов ВИЧ: gp 120 и gр 41, адсорбированные на поверхности полистироловой лунки

3. антиглобулиновая сыворотка, меченная пероксидазой, полученная путём иммунизации кроликов глобулинами человека (АТ к АТ-м).

4. ОФД

5. фосфатно-солевой буфер

6. контрольные сыворотки:

- положительная

- отрицательная

Ход работы.

1. Внесение контрольных и исследуемых сывороток

2. Инкубация 30 минут при 37⁰ С

3. Отмывание

4. Внесение антиглобулиновой сыворотки меченой ферментом

5. Инкубация 30 минут при 37⁰ С

6. Отмывание

7. Внесение ОФД

Механизм.

Реакция протекает в 3 фазы:

1. Антитела к ВИЧ исследуемой сыворотки связываются с гомологичными антигенами (gр 120 и gр 41), и на поверхности сорбента образуется ИК АГ-АТ ( АГ ВИЧ - АТ к ВИЧ)

2. Образование ИК АГ-АТ-АТ, меченое пероксидазой, т.к. АТ исследуемой сыворотки являются антигенами для антиглобулиновой сыворотки

3. ОФД взаимодействует с пероксидазой комплекса АГ-АТ-АТ, и происходит жёлтое окрашивание раствора лунки. Степень ферментативной активности прямо пропорциональна концентрации исследуемых АТ.