1.13. Методы генетического анализа микроорганизмов

Современные знания об организации генома микроорганизмов основаны, главным образом, на генетическом анализе, а не на химическом анализе последовательности нуклеотидов в ДНК. Генетический анализ позволяет составить подробные карты генетической организации хромосом. Длительное время методы генетического анализа развивались применительно к генетике диплоидных эукариотических организмов, жизненный цикл которых включал мейоз. Однако, когда этот же подход был использован для анализа мутаций E.coli, возникло множество затруднений. Только после открытия класса генетических элементов, характерных для прокариотов (плазмид, транспозонов), появилась возможность применить методы генетического анализа к бактериям. Плазмидный профиль весьма полезен для типирования условнопатогенных микроорганизмов. Плазмиды являются внехромосомными факторами наследственности, представленными двунитчатой циклической ДНК, содержащей от 10 до 100 генов (гены резистентности и вирулентности). Развитие быстрых и недорогих методов экстракции плазмидной ДНК и разделения плазмид на основе их размера в агарозном геле позволило широко использовать эти методы как в генетическом анализе, так и в эпидемиологических исследованиях.

Генетический анализ состоит в экспериментальном изучении отношений, существующих между бактериями (мутантами). Для определения этих отношений используют два основных приема:

1) рекомбинационный - определяет пространственное расположение генов (или мутаций) на генетической карте, т.е. картирование генома;

2) комплементационный - определяет функциональные отношения генов

(или мутантов).

Бактерии, способные к быстрому размножению, дают возможность затрачивать на эксперимент сравнительно небольшое время. Кроме того, методы отбора мутантов или рекомбинантов просты и доступны. Основной прием отбора - применение набора минимальных сред (например, с одной аминокислотой) в сочетании с посевом штампом-репликатором. Такой метод позволяет установить характер мутации (или рекомбинации) и расположение соответствующего гена на генетической карте. Наиболее часто применяются следующие методы картирования:

1) с помощью прерванной конъюгации (с посевом микробов на минимальные среды через определенные интервалы времени в процессе конъюгации);

2) с помощью трансдукции (т.е. с помощью фага);

3) с помощью трансформации (после искусственного разрушения бактерий-доноров изучают характер изменений бактерий-реципиентов).

Генетический анализ может проводиться и с помощью ДНК-(РНК)-зондов в реакции гибридизации. Этот метод важен не только с теоретической точки зрения, но и с практической - как наиболее специфичный метод идентификации микробов и вирусов.

ДНК-(РНК)-зонд - это одноцепочечный радиоактивномеченный (³²Р и др.) фрагмент ДНК (РНК). Эти фрагменты нуклеиновых кислот получают: а) при рестрикции (расщеплении молекулы на две цепочки) участка ДНК (РНК) известных микроорганизмов, б) путем химического синтеза. Реакция гибридизации состоит из следующих этапов:

1) разрушение исследуемых микробов, денатурация и рестрикция ДНК (нужны одноцепочечные участки) и фиксация на полимерной пленке;

2) внесение ДНК-зонда. Если зонд комплементарен с ДНК исследуемых микробов, то произойдет связывание, т.е. гибридизация, несвязавшиеся зонды удаляют промыванием;

3) учет результатов - с помощью авторадиографии.

Другой важной реакцией, основанной на методах генной инженерии является цепная полимеразная реакция (ЦПР), применяемая в медицинской микробиологии, вирусологии, иммунологии. Сущность метода заключается в получении из материала от больного не микроорганизма, а одноцепочечных фрагментов генома (ДНК), его биосинтезе с последующей идентификацией видоспецифических фрагментов молекулярно-генетическими методами. Биосинтез осуществляют в специальных физико-химических условиях. Реакционная смесь содержит матрицу (одноцепочечный фрагмент ДНК исследуемого возбудителя), нуклеотиды, праймеры (т.е. участки ДНК, с которых начинается биосинтез), фермент полимеразу. В результате ЦПР образуются копии ДНК исследуемых микроорганизмов, которые можно идентифицировать в реакции гибридизации.