Лабораторная работа № 5. Итоговая работа по клонированию дрожжей

Общие сведения.

Лимонная кислота широко применяется в производствах: в кондитерском, безалкогольном, различных экстрактов и в ряде не пищевых отраслей (полиграфии, кожевенной промышленности, в медицине и т.д.).

Раньше единственным способом получения лимонной кислоты являлась её экстракция из различного растительного сырья: цитрусовых плодов, махорочный лист, листья и отходы переработки хлопчатника, плодов дикорастущих гранатов и др. Однако все эти производства были вытеснены более эффективным микробиологическим методом: ферментативное производство лимонной кислоты из мелассы даёт более дешёвый конечный продукт, в десять раз по сравнению с махорочным листом и впять раз по сравнению с сырье из хлопчатника и дикорастущим гранатом.

Возможность получения лимонной кислоты путём культивирования микробиологических грибов на сахарных питательных средах открыта немецким ботаником К. Вемером в 1893 году и с 20-х годов текущего века её технология начала интенсивно разрабатываться. В настоящее время во многих развитых странах эффективно работают современные предприятия по производству лимонной кислоты глубинным способом.

Производство лимонной кислоты химическим синтезом возможно, но экономически не целесообразно, т.к. эта технология многостадийна, требует применения дорогого сырья и сильно токсичных реагентов (циановодорода, хлора и др.) и даёт относительно низкий выход целевого продукта. Преимущество микробного способа заключается в последовательном ферментативном осуществлении в клетке большого числа химических реакций в одну производственную стадию – ферментацию. Это упрощает технологию, увеличивает выход кислот и снижает их себестоимость.

В качестве сырья для ферментативного получения лимонной кислоты в большинстве стран используют мелассу – побочный продукт производства сахара из сахарной свеклы или сахарного тростника. Однако теоретически можно использовать растворы уксусной кислоты, ацетатов, метилового и этилового спирта, н-парафины и т.д.

Лимонная кислота принадлежит к классу ациклических аминокислот, т.е. соединений, содержащих одновременно спиртовый гидроксил и карбоксильную группу. Её формула: СООН

|

НООС – СН₂ – С(ОН) – СН₂ – СООН

(окситрикарбаллиловая кислота), т.е. это трёхосновная многоатомная оксикислота.

Наиболее широко распространённый м.о. – продуцент лимонной кислоты – специальный мутантный штамм микроскопического плесневелого гриба Aspergillus niger. Известны два способа ферментации: глубинный и поверхностный. По первому из них мицелий гриба погружён в питательную среду в ферментёрах, по второму – мицелий располагается на поверхности среды в открытых кюветах, размещённых на многоярусных стеллажах в специальных растильных камерах. Так как грибы рода Aspergillus являются строгими (облигатными) аэробами, то в ферментёры и растильные камеры непрерывно подают стерильный воздух. При дыхании гриба и образовании кислоты выделяется тепло, которое отводят из ферментёров пропусканием холодной воды через теплообменник, а из камер – продуванием воздуха, поддерживая температуру питательной среды 30 – 32 ^оС.

Принципиальная технологическая схема производства лимонной кислоты.

сахаросодержащее сырьё

вода кислота или

п итательные соли подготовка питательной среды щёлочь

пар ГЦ ФК* или

катионит

подросший мицелий

или конидий ферментация

с терильный воздух

холодная вода

отделение мицелия и мицелий гриба

суспенгированных примесей и примеси

и звестковое молоко осаждение щавелевой

пар кислоты

отделение оксалата оксалатный

кальция шлам

известковое молоко

пар осаждение лимонной

кислоты

г орячая вода отделение и промывка цитрата кальция фильтрат

с ерная кислота

пар

ГЦ ФК разложение цитрата

сульфид бария

г орячая вода отделение и промывка гипсовый шлам

гипсового шлама

п ар первое выпаривание раствора лимонной кислоты

а ктивированный осветление раствора отработанный

уголь лимонной кислоты и фильтрование уголь

пар второе выпаривание раствора

лимонной кислоты

холодная отделение и промывка кристаллов маточный

вода лимонной кислоты раствор

горячий сушка кристаллов

воздух лимонной кислоты

упаковка (фасовка)

* ГЦ ФК – гексацианоферрат калия

Задание.

Ознакомиться с биохимическими и микробиологическими основами получения лимонной кислоты биотехнологическим методом, изучить технологию процесса, освоить методики анализа.

Ход работы.

Работа состоит из нескольких этапов.

I. Приготовление посевного материала.

Исходную культуру As.niger высеивают на 6 пробирок с сусло-агаром – это первый квартальный период. Пробирка № 1 используется для пересева снова на 6 пробирок второго квартального пересева; № 2 – остаётся в музее; № 3 – используется для пересева на 6 пробирок, предназначенных для трёх стадий производственного размножения спорового посевного материала; № 4 – используется в случае повторного пересева при трёхстадийном размножении спор; № 5 и № 6 – расходуются для микробиологического и биохимического контроля квартального пересева рабочего штамма.

Необходимость замены старой культуры вызывается накоплением в рабочей культуре малоактивных форм и снижением активности биосинтеза лимонной кислоты.

Первая стадия размножения посевного материала (стадия А) осуществляется на скошенном сусло-агаре. Любая из шести пробирок, полученных из пробирки № 3 квартального пересева, является исходной для получения посевного материала. Из неё производят посев на 12 пробирок скошенного сусло-агара, которые инкубируют трое суток в термостате при 32 ^оС, затем хранят при комнатной температуре.

Из этих 12 пробирок рабочего пересева пробирка № 1 может быть использована для очередного пересева также на 12 пробирок; № 2 сохраняется в музее; № 3 – идёт на засев конических колб стадии Б; № 11 и № 12 поступают на биохимический анализ. После пересева из всех пробирок берётся взвесь для микробиологического контроля, для чего производят посев на поверхность среды в чашки Петри.

Вторая стадия размножения посевного материала (стадия Б).

Готовят жидкую питательную среду (Журавского-Терентьевой): на 1 кг 3-5% солодового сусла (готовится разбавлением стандартного сусла) добавляют 2 г NH₄Cl; 0,25 г KH₂PO₄; 0,25 г MgSO₄ ^.7H₂O; 0,0125 г FeSO₄ ^.7H₂O. Среду разливают в конические стеклянные колбы ёмкостью 1 – 3 л слоем 1 см и стерилизуют в автоклаве при 1 атм. В течение 30 минут.

Пробирочные культуры стадии А (пробирки 3 – 10) в возрасте 12 – 16 суток используют для засева питательной среды в конических колбах. Из каждой пробирки стадии А засевают две трёх литровые колбы с площадью дна 2 см² каждая. После засева колбы в течение 3 – 4 суток выдерживают в термостате при температуре 32 ^оС, затем хранят 4 – 6 суток при комнатной температуре (или 6 – 11 суток в холодильнике при температуре 5 ^оС). Выращенные в конических колбах спороносные плёнки (стадия Б) через 7 – 15 суток после посева для следующей стадии В. В стерильных условиях плёнки переносят пинцетом в плоские кюветы и высушивают в сушильном шкафу. Затем сухие конидии собирают специальным приспособлением типа пылесоса. С двух плёнок мицелия штамма 82 собирают около 1 г конидий.

Третья стадия (В). На стадии В применяют среду Журавского (солодовое сусло плотностью 7% 10 г/л NaCl + 1 г/л мочевины), разлитую по 1000 мл в специальные плоские ёмкости, а затем простерилизованную в автоклаве при 1 атм. В течение 4 – 5 суток высеивают в термостате при температуре 32 ^оС, а затем до употребления хранят при температуре не выше 10 – 12 ^оС.

10 – 15 суток спороносные плёнки стадии В используют для заготовки сухих спор. Для этого грибки плёнки высушивают при температуре 36 – 38 ^оС в течение 4 – 5 часов и собирают споры в закрытую ёмкость (бюкс).

II. Стадия получения лимонной кислоты.

II. а. Для поверхностного культивирования применяют конические колбы ёмкостью 0,5 л с площадью дна 0,8 дм², куда наливают по 160 мл питательной среды состава, г/л: сахароза – 75; NH₄NO₃ – 3 (или NH₄Cl – 4); КН₂РО₄ – 0,5; MgSO₄ ^. 7H₂O – 0,5; ZnSO₄ ^.7H₂O – 0,05; FeSO₄ ^. 7H₂O – 0,25. Питательную среду после стерилизации засевают споровой взвесью, содержащей 300 – 350 тыс. конидий в 1 мл через 42 – 44 часа роста при температуре 31 ^оС питательный раствор под выросшей плёнкой заменяют таким же количеством бродильного (производственного) раствора состава, г/л: 200 г сахарозы + 1,91 г NH₄Cl. Через 4 суток из-под плёнки сливают и в нём определяют титрованием количество кислот. Под плёнку наливают 100 мл воды, кипятят, плёнку отжимают и в отжиме также определяют количество кислоты, которое суммируют с количеством кислоты в сброженном растворе. Обычно плёнка гриба As.niger штамма 82 площадью 0,8 дм² за четверо суток синтезирует 18 – 22 г кислоты.

II. б. Для глубинного культивирования используют лабораторные ферментёры с мешалкой.

В стерильный ферментёр заливают стерильную питательную среду состава, г/л: сахароза – 125; NH₄NO₃ - 2,5; КН₂РО₄ – 0,16; MgSO₄ ^. 7H₂O – 0,25.

После засева питательной среды споровой взвесью (150 – 200 тыс. конидий в 1 мл среды) культивирование ведут в течение 6 суток при температуре 32 ^оС на одной и той же питательной среде при непрерывном перемешивании и аэрировании стерильным воздухом (около 1,0 л/л ^. м). По окончанию процесса замеряют объём сброженной массы, раствор кипятят и фильтруют.

В сброженном растворе и мицелии определяют общую титруемую кислотность, состав кислот и остаточный сахар, обычно штамм 82 в глубинных условиях продуцирует за 6 суток 60 – 70 г лимонной кислоты на 1 л исходного раствора.

Выделение лимонной кислоты производят согласно привычной технологической схеме. В КЖ после отделения мицелия содержится смесь лимонной, глюконовой и щавелевой кислот, остатки сахаров и минеральные примеси. Выделение лимонной кислоты из КЖ основано на её свойствах, образовывать малорастворимую соль – трёхкальциевый цитрат. Нейтрализацию ведут при температуре около 100 ^оС в колбе с мешалкой и известковым молоком до рН 6,8 – 7,5. При этом цитрат и оксалат кальция выпадают в осадок, а глюконат кальция отделяют от раствора и тщательно промывают горячей водой. Смесь цитрата оксалата кальция загружают в колбу с мешалкой, заливают водой, добавляют активированный уголь, нагревают смесь до 60 ^оС, подают расчётное количество серной кислоты (по уравнению).

С а₃(С₆Н₅О₇)₂ + 3H₂SO₄ 2C₆H₈O₇ + 3CaSO₄.

Смесь кипятят 10 – 20 мин. Оксалат кальция в этих условиях не разлагается. Отфильтрованный раствор лимонной кислоты на упаривание при плотности 1,24 – 1,26 г/см³ из раствора выпадает осадок гипса, его отфильтровывают и продолжают упаривание до плотности 1,35 – 1,36 г/см³, что соответствует 80% концентрации лимонной кислоты. Из упаренного раствора в кристаллизаторе после внесения затравки (кристаллов лимонной кислоты) при перемешивании и постепенном охлаждении до 8 – 10 ^оС ведут кристаллизацию. Образовавшиеся кристаллы отделяют, промывают небольшим количеством холодной воды и сушат. Товарный продукт должен содержать не менее 99,5% лимонной кислоты (в пересчёте на моногидрат).

Контрольные вопросы:

1. Общие сведения, история развития производства лимонной кислоты.

2. Технологическая схема производства лимонной кислоты микробиологическим методом.

3. Методика работы. Приготовление посевного материала.

4. Методика работы. Глубинное культивирование.

5. Методика работы. Выделение лимонной кислоты.