Литература

1. Промышленная микробиология / под. ред. Н.С. Егорова.  М.: Высшая школа, 1989. – 503 с.

2. Березовский, В.М. Химия витаминов / В.М. Березовский.  М.: Наука, 1973. – 489 с.

3. Теппер, Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильников, Г.И. Переверзева.  М.: Колос, 1993. – 321 с.

4. Нетрусов, А.И. Практикум по микробиологии / А.И. Нетрусов [и др.]. – М.: Академия, 2005. – 608 с.

5. Драк, А.И. Получение эргостерина без коагуляции дрожжевой массы / А.И. Драк, Г.И. Аксенович, В.В. Высоцкий, Я.С. Мелляр // Химико-фармацевтический журнал. – 1989.  № 6. – С. 4143.

6. Бабьева, И.П. Биология дрожжей / И.П. Бабьева, И.Ю. Чернов. – М.: Товарищество научных изданий КМК, 2004. – 221 с.

Практическая работа № 7. Клонирование дрожжей (3 пассаж)

Общие сведения.

Возбудители маслянокислого брожения — строгие анаэробы, подвижные палочки с клостридиальным или плектридиальным типом спорообразования.

По преобладанию тех или иных конечных продуктов маслянокислое брожение подразделяют на истинно маслянокислое брожение (брожение глюкозы, крахмала), ацетонобутиловое брожение, брожение пектиновых веществ.

Маслянокислые бактерии широко распространены в почве (как правило, содержатся в 90% почвенных образцов), навозе, загрязненных водоемах, в разлагающихся растительных остатках, молоке, на поверхности растений и т. д.

Процесс маслянокислого брожения протекает по схеме:

4С₆Н₁₂О₆ = ЗСН₃СН₂СH₂СООН + 2СН₃СООН + 8СО₂ + 8Н₂

Глюкоза Масляная Уксусная

кислота кислота

Кроме масляной, в процессе брожения в заметных количествах образуется уксусная кислота, а при подкислении среды (до рН 5,5) — значительные количества бутилового спирта и ацетона.

Энергетическим материалом для маслянокислых бактерий служит крахмал, водорастворимые углеводы (декстрины, ди-, моносахариды), органические кислоты (молочная, пировиноградная) и спирты (маннит, глицерин). В качестве источника азота бактерии используют самые различные азотистые соединения: пептон, аминокислоты, аммиачные соли, а некоторые — даже атмосферным азот.

Характерная особенность маслянокислых бактерий — способность накапливать в клетках гранулезу перед образованием спор.

Материалы и оборудование

МПБ, глюкоза, картофель, мел, колбы Вюрца. винтовые зажимы, каучуковые пробки и трубки, водоструйный насос или масляный насос Камовского, пробирки, пипетки, водяная баня, раствор Люголя (I + KI), 5%-ный раствор FеCI_3, предметные и покровные стекла, микроскопы.

Ход работы.

Для изучения маслянокислого брожения можно воспользоваться средой МПБ с добавлением 3—5% глюкозы. Чтобы в этой среде развивались преимущественно маслянокислые бактерии, следует создать, в нем строго анаэробные условия и после заражения почвой нагреть до кипения. При нагревании споры маслянокислых бактерий остаются жизнеспособными, а неспорообразуюшие бактерии погибают.

В колбу Вюрца объемом 250—500 мл наливают 30—50 мл питательной среды, вносят примерно 0,5 г почвы и ¼ чайной ложки мела для нейтрализации, образующейся в процессе брожения масляной кислоты. На асбестовой сетке колбу нагревают до кипения, не закрывая пробкой. Сняв с огня, колбу охлаждают под струей водопроводной воды, закрывают сверху каучуковой пробкой, а на боковой тубус надевают каучуковую трубку с винтовым зажимом. Присоединив колбу через каучуковую трубку к насосу (водоструйному или, лучше, масляному насосу Камовского), открывают винтовой зажим и выкачивают из колбы воздух до появления в среде пузырьков. Затем каучуковую трубку зажимают винтовым зажимом и колбу ставят в термостат при 30—35 °C.

Маслянокислое брожение крахмала также исследуют на среде с картофелем. Сырой неочищенный картофель нарезают мелкими кубиками, заполняют ими ¹/₃ высокой пробирки, добавляют немного мела, заливают водопроводной водой на ²/₃ и помещают на водяную баню при 80 ºС на 10 мин для пастеризации. В среду не вносят ни почвы, ни маслянокислых бактерий, так как на кожуре картофеля всегда есть их споры.

Элективные условия создают:

• наличием крахмала — источника углерода, используемого только микроорганизмами, содержащими фермент амилазу;

• пастеризацией;

• анаэробиозом (высокий столбик жидкости в пробирке и выделение в процессе брожения СО₂ и Н₂, вытесняющих воздух).

Через 2—3 дня картофель всплывает вследствие бурно идущего газообразования. По окончании брожения культуральную жидкость используют для исследования морфологии маслянокислых бактерий и качественного определения продуктов брожения.

Микроскопирование маслянокислых бактерий. Питательную среду из колбы Вюрца или пробирки с картофелем берут пипеткой, закрыв указательным пальцем верхний конец и погрузив ее кончик в средний слой сброженной жидкости. Слегка приподняв палец, набирают в пипетку жидкость, снова зажимают пальцем верхний конец пипетки и, вынув ее из колбы, наносят каплю на предметное стекло. К накопительной культуре добавляют каплю раствора Люголя и накрывают покровным стеклом, на которое наносят каплю кедрового масла.

При микроскопировании препарата обнаруживаются клетки Clostridium (от лат. close — закрыть, clostrum — замок, tridium — надолго, долгоживущие, поскольку имеют спору в жизненном цикле) butyricum (от греч. butyrum — масло), С. butylicum, С. pasteurianum (см. рис. 4, ж) и других бактерий, имеющих подобную форму. В клетках можно заметить овальные тельца, сильно преломляющие свет. Это споры. В тех местах клетки, где содержится гранулеза, возникает сине-фиолетовое окрашивание. Зарисовывают только окрашенные клетки, явно относящиеся к группе маслянокислых бактерий. Особенно хороший материал для наблюдений получается при постановке опыта на картофеле.

Качественные реакции на масляную кислоту. Получение маслянокислого железа (реакция с FeCl₃). Нейтральные растворы маслянокислых солей при нагревании с FeCI₃, приобретают коричневое окрашивание вследствие образования маслянокислого железа.

В пробирку наливают 3—5 мл сброженной жидкости, добавляют 1—2 мл 5%-ного хлорида железа и нагревают на пламени. Реакция идет по уравнению:

ЗСа(СН₃СН₂СН₂СОО)₂ + 2FeCl₃ =2Fe(CH₃CH₂CH₂COO)₃ + 3CaCl₂

Раствор маслянокислого железа в отраженном свете имеет буровато-коричневый цвет, а в проходящем свете — кроваво-красный.

Получение масляноэтилового эфира (ананасовой эссенции). К 3—5 мл культуральной жидкости в пробирке прибавляют 0,5 мл 96%-ного этилового спирта и 1-2 мл концентрированной серной кислоты. При взбалтывании и нагревании появляется характерный запах эфира (запах ананаса).

Реакция протекает по уравнению:

Са(СН₃СН₂СН₂СОО)₂ + 2СН₃СН₂ОН = СН₃СН₂СН₂СООСН₂СН₃+ Са(ОН)₂

Контрольные вопросы:

1. Возбудители маслянокислого брожения.

2. Методика микроскопирования маслянокислых бактерий.

3. Качественные реакции на масляную кислоту.

4. Формула маслянокислого брожения.