Практическая работа №2 Приготовление питательных сред для культивирования микроорганизмов

Общие сведения

Одной из основных задач микробиологии является выявление численности микроорганизмов (КОЕ — колониеобразуюших единиц) в том или ином субстрате. Однако универсальной сре­ды, на которой бы выявлялись все существующие в данном субстрате микроорганизмы, нет. Немецкий ученый Р. Кох пред­ложил относительно универсальную среду на основе мясного бульона, на которой хорошо развиваются микроорганизмы, ис­пользующие органические азотсодержащие соединения.

Позднее С. И. Виноградским в практику микробиологии были введены элективные, или избирательные, среды, пред­назначенные для определенных групп микроорганизмов. Они составлены в расчете на предельно строгие условия, при кото­рых должен развиваться только избранный микроорганизм и никакой другой. Основной принцип элективных сред — учет избирательных потребностей микроорганизма в специфиче­ских условиях развития. Зная физиологические особенности соответствующей группы микроорганизмов, можно подобрать не только химический состав среды, но и такие условия куль­тивирования (активную кислотность среды, условия аэрации, температуру и др.), при которых создается лабораторная ими­тации экологической ниши естественных условий обитания. Элективные среды позволяют осуществлять биологические процессы в лаборатории и на производстве без предваритель­ной стерилизации среды. Примером элективных сред могут служить среды для выделения азотфиксаторов, нитрификаторов. Эти среды применяют главным образом для выделения микроорганизмов из мест их природного обитания и получе­ния их накопительных культур.

Накопительные среды были предложены голландским ученым М. Бейеринком. В них интересующий исследователя компонент среды дается в избытке, чтобы выяснить, какой микроорганизм или группа микроорганизмов его используют, поскольку именно он или они будут доминировать в этой среде.

Оптимальные среды предложил А. А. Имшенецкий для целлюлозоразрушающих микроорганизмов, В. С. Буткевич — для продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger. Основной принцип оптимальных сред заключается в создании наиболее благоприятных условий для избранных микроорганизмов вне­сением в среду различных стимулирующих рост добавок (вита­минов, ростовых веществ, микроэлементов).

По составу среды подразделяются на две группы: естест­венные (натуральные) и синтетические.

Естественными обычно называют среды, которые состо­ят из продуктов животного или растительного происхождения, имеющих сложный неопределенный химический состав. Это — различные части растений, животные ткани, солод, дрожжи, навоз, почва, вода морей, озер и инеральных источ­ников. Их используют чаще в виде экстрактов или настоев. На естественных средах хорошо развиваются многие микроорга­низмы, так как в них есть все компоненты, необходимые для роста. Однако среды с неопределенным составом малопригод­ны для изучения физиологии обмена веществ микроорганиз­мов, поскольку не позволяют учесть потребление ряда компо­нентов среды, а также выяснить, какие вещества образуют микроорганизмы. Указанные недостатки связаны с тем, что со­став естественных сред очень сложен и непостоянен, так как существенно колеблется в зависимости от вида сырья и спосо­ба приготовления. Это заметно влияет на рост микроорганиз­мов. Естественные среды используют главным образом для поддержания культур микроорганизмов, накопления их био­массы и диагностических целей.

Синтетические — это такие среды, в состав которых вхо­дят в точно указанных концентрациях только известные хими­чески чистые соединения. Синтетические среды бывают прос­тыми и достаточно сложными по составу. Их широко используют для исследовании, связанных с изучением обмена веществ микроорганизмов.

Существуют и так называемые полусинтетические среды, относящиеся к средам с неопределенным составом. В них на­ряду с соединениями известной химической природы входят вещества неопределенного состава. Например, в мясной буль­он наряду со сложными и неопределенными по химическому составу веществами (мясной бульон) могут входить пептон, глюкоза или сахароза, поваренная соль, фосфат калия; карто­фельные среды содержат глюкозу и пептон. Полусинтетические среды широко используют в микробиологической практи­ке для получения витаминов, антибиотиков, аминокислот и других продуктов жизнедеятельности микроорганизмов.

Питательные среды могут быть различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие.

Плотные питательные среды используют для учета коли­чества бактерий, выделения чистой культуры и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5% агара или 10—15% желатины. При приготовлении полужидких сред вно­сят 0,1-0,2% агара.

Агар — это растительный коллоид, получаемый из неко­торых морских водорослей. В его состав входят главным обра­зом полисахариды, а также ничтожное количество азотистых веществ. Выпускают агар в виде пластин, стебельков, порошка. Большинство микроорганизмов не используют его в качестве субстрата, и поэтому агар удобен как инертный уплотнитель среды. Температура плавления агара — 100 ⁰С, затверде­вания — 40 ⁰С.

Желатина — кислый азотсодержащий продукт, добывае­мый при выварке костей, хрящей, сухожилий, чешуи рыб. Температура плавления желатины (22—25 °С) ниже температу­ры инкубации большинства микроорганизмов (30—37 °С). Эта особенность и способность многих микроорганизмов раз­жижать желатину, выделяя протсолитические ферменты, огра­ничивают се применение в качестве уплотняющею средства.

Плотными питательными средами служат также гелевые пластины, введенные в микробиологическую практику С. Н. Виноградским.

Для выращивания микроорганизмов, усваивающих орга­нические формы азота, часто употребляют мясо-пептонные сре­ды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар и мясо-пептонную желатину.

Задание.

Приготовить следующие питательные среды: мясную воду, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, дрожжевой автолизат, твердую и жидкую среды Сабуро, пивное сусло-агар, среду Чапека.

Ход работы

Мясная вода. Мясо освобождают от костей, жира, пленок и сухо­жилий, пропускают через мясорубку, заливают двух- или четырехкрат­ным количеством водопроводной воды (по весу) и кипятят в течение часа. Жидкость фильтруют через вату или полотно, затем через фильт­ровальную бумагу; фильтрат измеряют и доливают до первоначального объема дистиллированной водой.

Разливают по 3-5-литровым бутылям и стерилизуют при 120° С в течение 30-40 минут.

Мясо-пептонный бульон (МТ1Б). К мясной воде добавляют 1% пеп­тона, 0,5% химически чистой поваренной соли и 10% воды (на выкипа­ние). Кипятят до растворения пептона, затем в еще горячем бульоне уста­навливают (насыщенным раствором едкого натра) рН 7,3-7,5. После до­бавления щелочи бульон еще раз кипятят в течение 15-20 минут и фильт­руют через бумажный фильтр. Бульон разливают по пробиркам (колбам) и стерилизуют при 120° С в течение 15-20 минут (после стерилизации рН, как правило, дает сдвиг на 0,2-0,3 в сторону кислой реакции.

Мясо-пептонный агар (МПА). На I л мясной воды берут 10 г пеп­тона и 5 г поваренной соли, варят в течение 30 минут, устанавливают рН, фильтруют, добавляют 30 г лучших сортов архангельского агара (одес­ского нужно брать 60 г), нагревают до полного растворения и проверяют реакцию. Фильтруют через вату или марлю (в теплом автоклаве), а затем прозрачную среду разливают по колбам и стерилизуют при 120° С в те­чение 15-20 минут.

Дрожжевой автолизат используют для приготовления основного питательного субстрата в плотных агаровых средах. Хлебные и пивные дрожжи содержат 40-60% азотистых веществ, а также ряд ферментов, способствующих их самоперевариванию. Дрожжевые среды обеспечи­вают пышный рост, несмотря на низкое содержание общего азота и сла­бую степень его расщепления.

Прессованные пекарские дрожжи нарезают небольшими кусками и закладывают в бутыли с таким расчетом, чтобы автолизат занимал око­ло 1/5 вместимости бутыли (4 кг дрожжей на 20-литровую бутыль). Бу­тыль с дрожжами ставят на 2 суток в термостат при температуре около 60° С. По мере разжижения дрожжей бутыль встряхивают для равно­мерного прогревания содержимого (1-2 раза в сутки). Конец автолиза характеризуется полным расжижением дрожжей. Автолизат должен иметь коричневый оттенок и приятный запах.

Качество автолизата ухудшается, если процесс протекает при температуре ниже 58° С. По окончании автолиза в бутыль добавляют тройное (по исходной массе дрожжей) количество теплой водопро­водной воды (на 4 кг дрожжей 16 л воды). Разведенный автолизат помещают в автоклав для стерилизации при 1-1,3 атм (120-123° С) на 30 мин. Оставляют на несколько дней (не меньше 5-7 дней) для от­стаивания.

Твердая среда Сабуро (для дрожжей и грибов). Основой этой среды является дрожжевая вода. На 1 л водопроводной воды берут 80 г прессованных пекарских дрожжей (или 20 г сухих дрожжей), кипятят 15 мин, фильтруют через бумажный фильтр, разливают по флаконам и стерилизуют при 1 атм 20 мин. К 100 мл стерильной дрожжевой воды добавляют 1% пептона, 2% агара, нагревают до растворения агара, за­тем добавляют 4% глюкозы (или мальтозы), фильтруют, разливают в пробирки и стерилизуют при 0,5 атм 20 мин. Среду можно готовить и не на дрожжах, а на 1 %-ной пептонной воде. После стерилизации среду в пробирках скашивают.

Жидкая среда Сабуро отличается от описанной выше тем, что не содержит агара. Среду разливают в колбы по 150-200 мл, стерилизуют также, как описано выше. Эта среда употребляется главным образом для получения гемокультуры.

Пивное сусло-агар (для дрожжей и грибов). Неохмеленное пив­ное сусло разводят водопроводной водой до содержания сахара 7-8% по Баллингу (измеряют сахарометром) и стерилизуют при 110° С 10 мин. В таком виде сусло может сохранятся длительное время. Перед употреб­лением надосадочную жидкость осторожно сливают с осадка. В 1 л сте­рильного сусла добавляют 18 г агара, нагревают до растворения агара и разливают по колбам. Стерилизуют при 110° С 10 мин. Жидкое сусло после сливания отстоявшейся жидкости с осадка разливают в пробирки или колбы и стерилизуют при режиме, указанном для сусло-агара.

Среда Чапека (для грибов) (г/л):

NаNОз - 2; КС1 - 0,5; КН₂РО₄ - 1; Fе₂(SО₄)_{3 *}7Н₂О - 0,01; Мg5О_{4 *}7Н₂О -0,5; рН 5,2. Стерилизуют при давлении 0,5 атм в течение 20 мин. После сте­рилизации в колбы над пламенем горелки добавляют источник углерода.

Контрольные вопросы:

1. На какие группы можно разделить питательные среды, дайте их характеристику?

2. Роль агара и желатины в приготовлении питательных сред?

3. Основные соли, макро и микроэлементы, используемые при приготовлении питательных сред.

4. Нетрадиционные виды сырья, используемые при приготовлении питательных сред.