Бактериологическая диагностика туберкулёза

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КАФЕДРА ФТГОИОПУЛЬМОНОЛОГИИ

СОВРЕМЕННАЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ТУБЕРКУЛЕЗА

Минск 2003

Методические рекомендации

,

УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73 С 56

Авторы: канд. мед. наук, асе. Г.С. Авдеев; ст. науч. сотр. НИИ пульмонологии и фтизиатрии О.М. Залуцкая; канд. мед. наук, доц. П.С. Кривонос; д-р мед. наук, рук. отдела иммуноморфологических исследований Л.К. Суркова; канд. мед. наук, асе. В.В. Пылишев

Рецензент д-р мед. наук, доц. каф. фтизиопульмонологии Белорусской ме­дицинской академии последипломного образования А.Н. Лаптев

Утверждено Научно-методическим советом университета в качестве методических рекомендаций 28.05.2003 г., протоколе» 7

Современная бактериологическая диагностика туберкулеза: Метод, рекомен-С 56 дации / Г.С. Авдеев, О.М. Залуцкая, П.С. Кривонос и др. - Мн.: БГМУ, 2003. - 22 с.

Рассматриваются современные методы бактериологической диагностики туберкулеза. В частно­сти подробно излагаются методики забора материала для исследования, бактериоскопическое исследо­вание, люминисцентная микроскопия, культуральное исследование, биологические методы и основные молекулярно-генетические методы диагностики туберкулеза.

Предназначаются для студентов 4-6 курсов медицинского факультета иностранных учащихся, лечебного, педиатрического, медико-профилактического факультетов, для клинических ординаторов, стажеров и врачей-фтизиатров.

УДК 616.24-002.5-078 (075.8) ББК 55.4 я73

© Белорусский государственный медицинский университет, 2003

9. Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний.

Контрольные вопросы по теме занятия:

1. Возбудитель туберкулеза: история открытия, основные свойства, так­сономическое положение.

2. Правила сбора мокроты для исследования на туберкулез.

3. Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену: методика, интерпретация результатов.

4. Люминесцентная микроскопия.

5. Культуральное исследование на туберкулез: методика, интерпретация результатов.

6. Основные методы определения лекарственной устойчивости микобак­терии.

7. Автоматические системы для детекции микобактерии и определения лекарственной устойчивости.

8. Биологические методы диагностики туберкулеза.

9. Амплификационные методы, используемые для детекции микобакте­рии. ПЦР.

10. Генотипирование микобактерии туберкулеза.

УЧЕБНЫЙ МАТЕРИАЛ Возбудитель туберкулеза

Род Mycobacterium — единственный представитель группы 21 «Микобак­терии». Согласно девятому изданию «Определителя бактерий Берджи» этот род объединяет свыше 100 видов микобактерии; в клиническом диагностическом материале обычно определяется 10-12 видов микобактерии, 6 из которых пато­генны для человека. Это М. tuberculosis, M. bovis, M. qfricanum, M. avium, М. хепор и М. fortuitum. Хотя клеточная стенка микобактерии сходна с клеточ­ной стенкой грамположительных бактерий и представляет собой многослойный пептидогликановый комплекс, с ней связаны преимущественно липиды (мико-ловые кислоты, воски, фосфолипиды и ацетилированные трегалозы), а не белки и полисахариды, как у других бактерий. Это придает клеточной стенке мико­бактерии сильные гидрофобные свойства. В дополнение к липидам, которые могут составлять до 60% клеточной стенки, клетки микобактерии содержат уг­леводы и растворимые белки. Клеточная стенка микобактерии создает гидро­фобный барьер, затрудняющий проникновение в клетку водорастворимых со­единений. Вследствие этого микобактерии демонстрируют весьма медленную скорость роста и являются естественно устойчивыми к химическим воздействи­ям, в том числе к кислотам, спиртам и к большинству используемых в настоящее время антибиотиков. Поэтому выбор препаратов для лечения больных туберку­лезом и другими заболеваниями, вызываемыми микобактериями, ограничен.

Клетки микобактерии прямые или слегка изогнутые, имеют размеры 0,2-0,7 х 1,0-10 мкм. Микобактерии не образуют спор, жгутиков, мицелия и

4

капсул, одцако имеют микрокапсулу, отделенную от клеточной стенки осмие-фобной зоной. Типовой вид рода Mycobacterium — М. tuberculosis (МБТ). Ми­кобактерии характеризуются плеоморфизмом: клетки в молодых культурах имеют палочковидную форму, в старых — чаще кокковидную. Микобактерии иногда образуют L-формы, сохраняющие инфекционность_г а также фильтрую­щиеся формы (их патогенетическая роль изучена недостаточно). Вирулентные штаммы М. tuberculosis обладают так называемым*корд-фактором (трегалоза-6,6'-димиколат), обусловливающим слипание бактериальных клеток в микро­колониях. Микобактерии являются аэробами, но способны расти в факульта­тивно анаэробных условиях; концентрация С0₂ 5-10% способствует более бы­строму росту. Размножаются делением, время генерации составляет 14-18 ча­сов (для сравнения у E.coli — 20 минут). У микобактерии направления репликативной вилки и транскрипции совпадают только у 56% генов (для сравнения, у Bacillus subtilis этот показатель составляет 78%), что является еще одной причиной медленного роста. Для роста in vitro микобактерии нуждаются в белковом субстрате и глицерине, а также в углероде, хлоре, сере, фосфоре, азоте, факторах роста (биотине, никотиновой кислоте, рибофлавине и др.), в ионах (Mg²⁺, K⁺, Na⁺, Fe²⁺). Температурный оптимум составляет 37-3 8°С, опти­мум рН 7,0-7,2.

Диагностический материал для исследования на туберкулез

При исследовании с целью выявления МБТ можно использовать любой патологический материал: мокроту, которую выделяет больной, или получен­ную после раздражающей ингаляции; бронхиальный секрет; бронхоальвеоляр-'ный смыв (БАС); материал катетер- и аспирационной биопсии, полученный при бронхоскопии; аспираты из трахеи; экссудат; транссудат из плевральной и брюшной полостей; гной из натечников и свищей; мочу; спинномозговую жид­кость; содержимое открытых ран; менструальную кровь; соскобы эндометрия; сперму; секрет предстательной железы; пунктаты яичек; биопсийный, аутоп-сийный материал; органы экспериментальных животных; смывы с предметов больничной среды и др. Использование бронхоскопии для взятия микробиоло­гических образцов оправдано только при многократных неудачных попытках получения материала более простыми способами у больных с неясным диагно­зом. В ряде случаев, когда больному трудно откашлять мокроту, прибегают к специальным методам, например, стимуляции выделения мокроты. Мокрота, собранная после стимуляции, по внешнему виду напоминает слюну, поэтому такой материал перед направлением в лабораторию снабжают специальной маркировкой («индуцированная мокрота»).

Все клинические образцы, предназначенные для бактериологического ис­следования, должны быть собраны до или в течение первых нескольких дней химиотерапии, поскольку в некоторых случаях нескольких дней специфиче­ской терапии достаточно для того, чтобы прекратить бактериовыделение, и то­гда бактериологическое исследование бесполезно.

5

Эффективность микробиологической диагностики туберкулеза в значи­тельной степени зависит от правильности сбора диагностического материала. От соблюдения правил сбора, хранения и транспортировки диагностического материала зависит также эпидемиологическая безопасность окружающих.

Мокроту (основной диагностический материал для исследования на ту­беркулез) собирают в специальные стеклянные баночки емкостью около 50 мл с герметически закрывающимися крышками. Необходимо использовать баночки с широким горлышком (диаметр не менее 35 мм), чтобы пациент мог легко со­брать мокроту без контаминации наружной поверхности баночки. Мокроту можно собирать также в одноразовые плевательницы, которые после использо­вания подлежат уничтожению. Посуда для сбора мокроты должна быть сделана из прозрачного материала, чтобы можно было определить количество и состоя­ние собранного материала, не снимая крышку с баночки.

Мокрота для исследования должна собираться под контролем медицин­ского персонала с обязательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты, которые сводятся к следующему:

1. Добейтесь взаимопонимания с больным и объясните ему, для чего не­обходимо провести исследование мокроты, как нужно откашливать мокроту из глубоких отделов легких. Объясните больному, что он не должен собирать слюну или носоглоточную слизь.

2. Проинструктируйте больного, чтобы он прополоскал рот перед сдачей мокроты. При этом из полости рта удаляются остатки пищи и контаминирую-щие бактерии.

3. Пациент должен сделать два глубоких вдоха и задержать дыхание на несколько секунд после каждого из них, а затем медленно выдохнуть. Затем вдохнуть в третий раз и с силой выдохнуть воздух. Потом вдохнуть еще раз и затем покашлять. Это способствует получению мокроты из глубоких отделов легких.

4. После появления продуктивного кашля пациент должен поднести к губам контейнер и аккуратно сплюнуть в него мокроту. Нередко мокрота быва­ет густой и слизистой, хотя может быть и жидкой, с частицами некротических тканей из пораженных участков легких. Цвет мокроты может быть грязно-белым или грязновато-светло-зеленым. Мокрота с примесью крови имеет крас­ный или коричневый цвет.

5. Жидкая прозрачная слюна или выделения из носоглотки не являются мокротой и имеют небольшую ценность при диагностике туберкулеза.

6. Для исследования необходимо получить достаточное количество мок­роты (3-5 мл), содержащей плотные гнойные частицы, а не слюну.

Во время продуктивного кашля пациента образуется аэрозоль, содержа-щий МБТ. В целях обеспечения мер безопасности при откашливании мокроты пациентом и предупреждения инфицирования медицинского персонала потен­циально заразными аэрозолями сбор мокроты должен осуществляться в специ­ально оборудованном помещении, оснащенном бактерицидными лампами, ло­кальной вытяжной вентиляцией, в присутствии медицинского персонала с обя­зательным проведением инструктажа о правилах сбора мокроты. Если условия

б

этого не позволяют, то сбор мокроты проводят вне помещения (на открытом воздухе) или в помещении, где нет других людей, под контролем медицинского работника. В любом случае нельзя собирать мокроту в замкнутых помещениях. Образцы мокроты от одного пациента не объединяют в одном сосуде, а направ­ляют в лабораторию с указанием сведений о пациенте для каждой пробы. Дос­тавку мокроты в лабораторию осуществляют сразу после взятия в плотно за­крытом промаркированном контейнере, помещенном в бикс для транспорти­ровки. Если транспортировка откладывается, собранную мокроту следует хра­нить в холодильнике при 4°С не более одних суток или в консерванте не более трех суток.

Методы бактериологической диагностики туберкулеза

Бактериологическая лаборатория играет существенную роль в выявлении, диагностике туберкулеза, выборе рациональных схем химиотерапии и оценке их эффективности. Бактериологическая диагностика включает обработку кли­нического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорга­низма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических тестов, а также опреде­ление лекарственной чувствительности микобактерий.

Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культураль-ное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ), автоматические системы (MGIT, BACTEC, MB/BacT, ESP Cul­ture System и др.), молекулярно-генетические методики (PCR, LCR, NASBA, Q-Beta и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительно­стью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интер­претации полученных результатов.

Таблица 1 Чувствительность различных методов бактериологической диагностики туберкулеза

Метод исследования	Чувствительность
Бактериоскопия	50-100 тыс. клеток в 1 мл
Культуральное иследование (посев)	10-100 клеток в пробе
Биопроба	1-10 клеток в пробе
ГЩР	1-10 клеток в пробе

Таблица 2 Длительность бактериологического исследования

Метод исследования	Длительность
Бактериоскопия	24 часа
Культуральное исследование	3-10 недель
Биохимическая идентификация	17-21 день
Определение лекарственной чувствительности микобактерий	28 дней
Биопроба	3 месяца
Всего	66-120 дней

7

В таблицах 1 и 2 представлены чувствительность различных методов бак­териологической диагностики туберкулеза и длительность проведения бакте­риологического исследования.

Бактериоскопическое исследование. Бактериоскопическое исследова­ние мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислото­устойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных ту­беркулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико-диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ве­домств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, ко­торая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое ис­следование, проведенное должным образом, имеет положительную прогности­ческую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способ­ность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокро­ты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.

Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бак-териоскопическом выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате ми­кобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфиче­ское окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краси­тель при обработке кислотой или спиртом.

В бактериологических лабораториях, выполняющих большое количество исследований (100 и более ежедневно), используется люминесцентная микро­скопия. Данный метод основан на способности липидов микобактрий воспри­нимать люминесцентные красители (акридиновый оранжевый, аурамин, рода­мин и др.) и затем светиться при облучении их ультрафиолетовыми лучами. В зависимости от красителей, микобактерий туберкулеза дают четкое ярко-красное свечение на зеленом фоне или золотисто-желтое - на темно-зеленом фоне. Метод люминесцентной микроскопии обладает большей чувствительно­стью, чем световая микроскопия, особенно в сочетании с методом обогащения диагностического материала (микроскопия осадка), поскольку люминесцентная микроскопия позволяет обнаружить измененные микобактерий, утратившие кислотоустойчивость, в связи с чем они не выявляются при бактериоскопии по Цилю-Нильсену. Мазки для люминесцентной микроскопии готовят из осадка, полученного после обработки диагностического материала детергентом с по­следующим отмыванием либо нейтрализацией. При положительном результате бактериоскопии мазков, окрашенных флуорохромами, должна быть проведена подтверждающая микроскопия мазков, окрашенных по Цилю-Нильсену.

8

Бактериоскопическое исследование необходимо проводить очень тща­тельно. Обычно образец исследуют в течение 15 минут (что соответствует про­смотру 300 полей зрения), чтобы сделать заключение об отсутствии или нали­чии КУБ в препарате. При окрашивании флюорохромами для исследования од­ного мазка требуется меньше времени.

Основным диагностическим материалом для бактериоскопии на КУБ служит мокрота. Результаты бактериоскопического исследования на КУБ дру­гих биологических материалов (различных жидкостей, тканей, гноя, мочи и т.д.) имеют ограниченное значение для диагностики туберкулеза. Так, исследо­вание мазков из осадка центрифугированной мочи не всегда позволяет полу­чить достоверные результаты, поскольку в моче могут присутствовать нетубер­кулезные микобактерии. Поэтому выявление КУБ в моче не всегда свидетель­ствует о наличии специфического процесса. В мазках из осадка промывных вод желудка и других материалов могут обнаруживаться кислотоустойчивые са-профиты, которые легко спутать с МБТ.

Результат микроскопического исследования позволяет сделать заключе­ние только о наличии или отсутствии в препарате кислотоустойчивых бакте­рий. Достоверно диагноз «туберкулез» можно установить только после выделе­ния из клинического материала культуры МБТ с помощью культурального ме­тода и ее идентификации. Отрицательный результат бактериоскоскопического исследования не исключает диагноз «туберкулез», так как в мокроте некоторых пациентов может содержаться меньше микобактерии, чем позволяет выявить бактериоскопия.

Количество обнаруженных КУБ определяет степень тяжести заболевания и опасности больного для окружающих. Следовательно, исследование должно быть не только качественным, но и количественным. Регистрация результатов с указанием количества обнаруженных КУБ представлена в табл. 3.

Таблица 3 Градация результатов микроскопического исследования при окраске по Цилю-Нильссну (ЮООх)

Количество кислотоустой-чи пых бактерия (КУБ)	Число иммерсион­ных поЛей >рення	Ответ
КУБ отсутствуют	100	КУБ не обнаружены (в 100 полях зрения КУБ не выявлены)
От 1 до 9 КУБ	100	Указывается точное количество (1-9 КУБ на 100 полей зрения)
От 10 до 99 КУБ	100	1+ Указывается точное количество (10-99 КУБ на 100 полей зрения)
. От 1 до 10 КУБ	1	2+ (1-10 КУБ на одно поле зрения в 50 просмотренных полях зрения)
Более 10 КУБ	1	3+ (более 10 КУБ на одно поле зрения в 20 просмотренных полях зрения)

9

В современных эпидемиологических и экономических условиях бакте-риоскопическое исследование мокроты у обратившихся в ЛПУ за врачебной помощью лиц с клиническими симптомами, подозрительными на туберкулез, является приоритетным направлением в тактике раннего выявления данного за­болевания. Возрастание роли этого метода связано также с возникновением в последние годы остропрогрессирующих форм заболевания, сопровождающихся выраженными клиническими проявлениями и обильным бактериовыделением.

Культуральное (бактериологическое) исследование. Начиная со вре­ мени проведения работ Коха и до 1924 г. усилия ученых, направленные на по­ иски методов выделения чистых культур микобактерий туберкулеза, не имели особых успехов. В 1924 г. Левенштейн и Сумиоши установили, что кислоты и щелочи в известных концентрациях и при определенных экспозициях убивают сопутствующую микрофлору, не влияя на жизнеспособность МБТ. Этот метод при непрерывном совершенствовании стал приобретать практическое значение. <

В настоящее время бактериологическое (культуральное) исследование биоло­гического материала на МБТ благодаря его высокой чувствительности (от 10 до 100 жизнеспособных микробных клеток в 1 мл исследуемого материала) и спе­цифичности в сочетании с микроскопическим методом является «золотым стандартом» в диагностике туберкулеза. Бактериологическое исследование на туберкулез выполняется в специализированных бактериологических лаборато­риях противотуберкулезных диспансеров или посевных пунктах.

Материал для бактериологического исследования собирают асептически. Перед проведением бактериологического исследования поступившие в лабора­торию пробы обрабатывают растворами кислот или щелочей с последующим центрифугированием. Это необходимо для разжижения и концентрации образ­ца, а также для предотвращения контаминации, поскольку пробы мокроты вяз­кие по консистенции и содержат большое количество микрофлоры. Около 1 мл разжиженного и деконтаминированного клинического образца засевают в про­бирки со средой и инкубируют при 37°С в течение 10 недель.

Для культивирования микобактерий используют плотные (яичные, агаро­вые) и жидкие питательные среды. Яичные среды содержат цельные яйца или яичный желток, а также фосфолипиды, белки и другие ингредиенты. С целью предотвращения контаминации к среде добавляют некоторые красители, на­пример, малахитовый зеленый, а также антибиотики. Поэтому яичные среды (Левеншейна-Иенсена, Финна), на которых культивируют микобактерий, име­ют сине-зеленый цвет. Использование яичных сред позволяет получить види­мый рост колоний М. tuberculosis через 18-24 дня в виде сухого морщинистого налета кремового цвета. Однако качество ингредиентов, из которых готовится среда, иногда значительно варьирует, что может влиять на воспроизводимость результатов. По сравнению с яичными агаровые среды имеют ряд преиму­ществ: они готовятся из полусинтетических основ, что обеспечивает более ста­бильное качество и воспроизводимость результатов. Детекция роста МБТ на агаровых средах возможна через 10-14 дней. Однако агаровые среды дороже, требуют присутствия С0₂ в атмосфере и инкубируются в термостате не более

10

1 месяца. Как правило, для выделения микобактерий используется набор из двух разных питательных сред.

Автоматические системы. Разработка радиометрической системы ВАСТЕС 460 (Becton Dickinson) ознаменовала собой качественный прорыв в быстрой детекции микобактерий и определении их лекарственной чувствитель­ности. Принцип ее функционирования заключается в следующем: бактериаль­ные клетки выращивают в жидкой питательной среде, содержащей источник углерода (пальмитиновую кислоту), меченный по ^ИС. Интенсивность роста бактерий в системе ВАСТЕС определяют путем измерения продукции меченого С0₂ в процессе жизнедеятельности бактериальных клеток. Следующим шагом было совершенствование методов выявления МБТ, что позволило быстро про­водить детекцию роста МБТ без использования радиоактивных материалов. Среди этих методов есть полностью неавтоматизированные, как, например, MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube, Becton Dickinson). С его помощью рост микобактерий оценивается по флюоресценции, возникающей при окисле­нии в процессе роста микобактерий присутствующего в среде 0₂-чувстви-тельного флюоресцентного индикатора. В настоящее время разработаны также полностью автоматические системы — ESP Culture System (Difco), в которой используется технология измерения давления на крышку пробирки, возникаю­щего в результате продукции и поглощения газа в процессе роста микобакте­рий. Интенсивность роста МБТ оценивается по времени детекции давления в сравнении с положительным контролем. Кроме того, разработаны автоматиче­ские нерадиометрические системы ВАСТЕС 9000 (Becton Dickinson) и МВ/ВасТ System (Organon technica), рост микобактерий в которых оценивается с использованием колориметрического сенсора, реагирующего на продукцию С0₂, растворенного в культуральной среде, растущими в среде микроорганиз­мами (табл. 4)

Таблица 4 Системы детекция микобактерий в жидкой питательной среде

Система	Принцип детекции микобактерий
MGIT	Флюоресценция, возникающая при окислении 02-чувствительного индикатора
ВАСТЕС 460	Измерение продукции меченого ССЬ
ВАСТЕС 9000	Колориметрическая детекция продукции С02
МВ/ВасТ	Колориметрическая детекция продукции С02
ESP Culture System	Давление на крышку пробирки, возникающее в результате проду­цирования и поглощения газа

Автоматические системы, предназначенные для выявления микобактерий туберкулеза, позволяют проводить детекцию роста микобактерий в 2-3.раза быстрее, чем классические методы. Положительный результат анализа должен обязательно подтверждаться бактериоскопически. В практике бактериологиче­ских лабораторий исследование с использованием автоматических систем обя­зательно проводится параллельно с исследованием на плотных питательных средах.